一种用于治疗急性t淋巴细胞白血病的新的二萜化合物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物技术领域，具体涉及从附子中分离得到的一种具有治疗急性Τ淋 巴细胞白血病作用的二萜类化合物及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 附子为毛茛科植物乌头aconitum carmichaeli debx.的子根的加工品。6月下旬 至8月上旬采挖，除去母根、须根及泥沙，习称"泥附子"。加工炮制为盐附子、黑附子（黑顺 片）、白附片、淡附片、炮附片。属温里药。中药中"回阳救逆第一品"。主产于四川、湖北、湖南 等地。附子始载于《神农本草经》，列为下品。陶弘景谓："乌头与附子同根，附子八月采，乌头 四月采，春时茎初生有脑头，如乌鸟之头，故谓之鸟头。"韩保升谓："正者为乌头，两歧者为 乌喙，细长三、四寸者为天雄，根旁如芋散生者为附子，旁连生者为侧子，五物同出而异名， 苗高二尺许，叶似石龙芮及艾"。苏颂谓："五者今并出蜀土，都是一种所产，其亩高三、四尺， 茎作四棱，叶如艾，其花紫碧色作穗，其实细小如桑椹状，黑色，本只种附子一物，至成熟后 乃有四物。"《本草纲目》载："乌头有两种，出彰明者即附子之母，今人谓之川乌头是也，其产 江左山南等处者，乃本经所列乌头，今人谓之草乌头是也。"
[0003] 附子的化学成分主要是生物碱类物质，此外还有脂类及多糖等。附子的毒性成分 是双酯型生物碱，其中主要是乌头碱、中乌头碱、次乌头碱等。在二萜类生物碱中，以乌头碱 的研究最全面，它的毒性和药理作用均有不少报道。乌头碱的主要毒性作用是抑制呼吸及 引起心律失常，其对心脏的直接毒性作用是使心肌细胞钠离子通道开放，加速钠离子内流， 促使细胞膜去极化，从而引起心律失常。二萜类醇胺为乌头碱，中乌头碱和次乌头碱相应生 物碱的水解产物。它们的毒性很小，大剂量只引起窦房传导阻滞而不引起异位节律和室颤。 附子的特点在于炮制，炮制的过程也即是将原来生品中所含毒性很强的双酯类生物碱水解 为毒性较小的单酯类碱，如继续水解则转变为毒性更小的胺醇类碱。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种从附子中分离得到的一种具有治疗急性T淋巴细胞白血 病作用的二萜类化合物及其制备方法。
[0005] 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
[0006] 具有下述结构式的化合物(I)，
[0008] 所述的化合物（I)的制备方法，包含以下操作步骤：（a)将附子粉碎，用75~85%乙 醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃 取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取 物用大孔树脂除杂，先用10%乙醇洗脱8个柱体积，再用75%乙醇洗脱10个柱体积，收集 75%乙醇洗脱液，减压浓缩得75%乙醇洗脱物浸膏；（c)步骤(b)中75%乙醇洗脱浸膏用正 相硅胶分离，依次用体积比为85:1、45 :1、25:1、12:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5 个组分；（d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1、12:1和5:1的二 氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶 分离，用体积百分浓度为70 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集8~10个柱体积洗脱液，洗脱液 减压浓缩得到纯的化合物(I)。
[0009] 进一步地，步骤(a)中，用80%乙醇热回流提取，合并提取液。
[0010]进一步地，所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。
[0011] 药物组合物，其中含有治疗有效量的所述的化合物(I)和药学上可接受的载体。
[0012] 所述的化合物(I)在制备治疗急性T淋巴细胞白血病的药物中的应用。
[0013] 所述的药物组合物在制备治疗急性T淋巴细胞白血病的药物中的应用。
[0014] 本发明化合物用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。
[0015] 该药物组合物含有治疗有效量的本发明化合物（I)，其余为药物学上可接受的、对 人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。
[0016] 所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料 以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明药物可 通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者。用于口服时，可将其制成片剂、缓释片、控 释片、胶囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂、口服液等;用于注射时，可制成灭菌的 水性或油性溶液、无菌粉针、脂质体或乳剂等。
【附图说明】
[0017] 图1为化合物(I)结构式；
[0018] 图2为化合物（I)理论E⑶值与实验E⑶值比较。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范 围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对 本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
[0020] 实施例1:化合物(I)分离制备及结构确证
[0021] 试剂来源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷为分析纯，购自上海凌峰化 学试剂有限公司，甲醇，分析纯，购自江苏汉邦化学试剂有限公司。
[0022] 制备方法：（a)附子（10kg)粉碎，用80%乙醇热回流提取(25LX3次），合并提取液， 浓缩至无醇味(3L)，依次用石油醚(3L X 3次）、乙酸乙酯(3L X 3次)和水饱和的正丁醇(3L X 3次)萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物(398g)和正丁醇萃取物；（b)步骤(a)中 乙酸乙酯萃取物用AB-8型大孔树脂除杂，先用10%乙醇洗脱8个柱体积，再用75%乙醇洗脱 10个柱体积，收集75%乙醇洗脱液，减压浓缩得75%乙醇洗脱物浸膏（163g);(c)步骤(b)中 75%乙醇洗脱浸膏用200-300目正相硅胶分离，依次用体积比为85:1 (8个柱体积）、45:1 (8 个柱体积）、25:1(8个柱体积）、12:1(10个柱体积)和1:1(5个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度 洗脱得到5个组分；（d)步骤(c)中组分4(49g)用200-300目正相硅胶进一步分离，依次用体 积比为20:1(8个柱体积）、12:1(10个柱体积)和5:1(5个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱 得至1」3个组分；（e)步骤(d)中组分2(30g)用十八烷基硅烷键合的反相硅胶0DS-C18分离，用 体积百分浓度为70 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集8~10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩 得到纯的化合物（I) (43mg)。
[0023] 结构确证:册431]\^显示[]\1+他]+为111/2 415.1418，结合核磁特征可得分子式为 C20H24〇8，不饱和度为9。核磁共振氢谱数据δΗ(ρρπι，DMS〇-d 6，600MHz): H-1 (2 · 22，m)，H-1 (1.98，m)，H-3(4.86，d)，H-4(2.14，d)，H-6(4.52，t，J = 8.9)，H-7(2.17，dd，J=14.4,8.4)， H-7(1.73，dd，J=14.4,9.6)，H-10(2.16，m)，H-ll(2.14，dd，J=14.4,8.4)，H-ll(2.25，dd， J=14.4,6.0)，H-12(5.21，dd，J = 8.4,6.0)，H-14(6.20，br，s)，H-15(7.29，br，s)，H-16 (7.26，1^，8)，!1-17(1.12,8)，!1-19(1.28,8)，!1-20(5.16,8);核磁共振碳谱数据6。(卯 111， DMS0-d6，150MHz):33.4(CH2，l-C)，212.3(C，2-C)，65.5(CH，3-C)，54.2(CH，4-C)，38.8(C，5-C)，84.1(CH，6-C)，41.3(CH2,7-C)，72.7(C，8-C)，55.5(C，9-C)，42.1(CH，10-C)，39.5(CH2， 11-C)，70.2(CH，12-C)，128.3(C，13-C)，107.6(CH，14-C)，143.4(CH，15-C)，138.0(CH，16-C)，26.3(CH 3，17-C)，177.2(C，18-C)，29.1(CH3，19-C)，105.3(CH，20-C) ;碳原子标记参见图 1 光谱显示该化合物含有羟基和内酯基团（3446CHT1和1772CHT1)。匪1?谱数据表明该化合 物含有一个典型的 单取代呋喃环[SH6.20(br，s，H-14)，7.29(br，s，H-15WP7.26(br，s， !1-16);3(：128.3((：-13)，107.6((：-14)，143.4((：-15)和138.0((：-16)〕，一个酯羰基[3(：177.2 (018)]，一个羰基[50212.3(02)]，三个含氧次甲基[5065.5((：-3)，84.1((：-6)和70.2((：-12)]，含氧季碳[6072.7(08)]，以及两个甲基[6!11.12(3!1，8，出-17)和1.28(3!1，8，出-19)]。 根据它的分子式和匪R数据，该化合物鉴定为高含氧二萜类化合物。HMBC谱中，H3-19与C-4， C-5，C-6和C-10以及H3-17与C-7，C-8和C-9的相关性表明化合物为含有5，8-二甲基双萜化 合物。HMBC谱中H-6与C-18以及H-3与C-18的相关性，表明存在一个γ -内酯环。此外根据 HMBC谱中，Η-12与C-12，C-14和C-16的相关性，可推断呋喃环位于C-12位上。NOESY谱中，Η3-19与Η-4，Η-6和Η-10相关性表明，它们均为α构型。Η-16和Η 3-17的相关性表明CH3-17为β构 型。此外，Η3-17与Η-20的相关性表明Η-20为β构型。综合氢谱、碳谱、HMBC谱和NOESY谱，以及 文献关于相关类型核磁数据，可基本确定该化合物如图1所示，立体构型进一步通过ECD试 验确定，理论值与实验值基本一致(图2)。
[0024]实施例2:化合物（I)药理作用试验
[0025] -、材料和仪器
[0026]急性Τ淋巴细胞白血病Molt4细胞由暨南大学血液病研究所惠赠;慢性粒细胞白血 病细胞K562细胞由暨南大学由生物化学与分子生物学教研室惠赠。化合物（I)为自制，HPLC 归一化纯度大于98%，用DMS0分析纯溶解配制成5.5yg/mL溶液备用。DMEM/F12培养基粉、羟 乙基哌嗪乙磺酸（HEPES)、四苯基氮哇蓝试剂（MTT)购于美国Gibeo公司。新生牛血清 (Newborn Calf Serum)购于中国杭州四季青公司。青霉素（Penicillin)、链霉素 (Streptomycin)购于华北制药公司中国。碘化丙睫(PT)购于美国Sigma公司。PI-Annexin V 双染试剂盒购于中国北京宝赛生物技术公司。R0S高质焚光测定试剂盒购于中国碧云天生 物技术研究所。Rhodam