一种杆菌肽及其锌盐的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于工业微生物技术领域，具体涉及一种杆菌肽及其锌盐杆菌肽锌的制备 方法。
【背景技术】
[0002] 杆菌肽(Bacitracin)最初是Johnson从患者伤口污染物中分离出的一株枯草芽孢 杆菌，经培养得到的多肽类抗生素。可由枯草芽孢杆菌(baciIlus sabtiI is)和地衣芽孢杆 菌(Baci Ilus Iicheniformis)产生。由于其对革兰氏阳性菌有较强的抗菌作用，与金属离 子络合后稳定性增强，抗菌活性更高。该药局部应用刺激小，过敏反应少见，耐酶，细菌对其 产生耐药性又较慢，获得耐药性菌株极为罕见。而且其活性不受脓液、痰液、血液、渗出液和 坏死组织的影响，故迄今常作为局部抗感染药而广泛使用。
[0003] 杆菌肽是由12个氨基酸组成的多肽类抗生素，其中含有一个7个氨基酸构成的环 肽。杆菌肽中含有杆菌肽A、B、C、D、E、F、G等多个组分，其中杆菌肽A生物活性最强。
[0004] 美国药典对药用杆菌肽各组分含量有严格的规定;其中杆菌肽A(HPLC相对保留时 间为1.0RT)含量不小于40%，杆菌肽BI、B2、B3、A(0.7RT，0.7RT，0.8RT，1.0RT)的峰面积之和 不小于70%，杆菌肽BU0.7RT)之前的峰面积之和不得大于20%，杆菌肽F(2.4RT)的峰面积不 大于6%。
[0005] 杆菌肽为多组分产品，美国药典对各组分含量有严格的规定。国内产品由于达不 到国外药典标准多为兽用制品，本产品的提取技术路线国内研究很少，郭淑琴、魏景新发表 的《树脂吸附法提取杆菌肽的研究》(沈阳化工1985.03.02)，使用离子交换法提纯杆菌肽， 可得到纯度54U/mg的杆菌肽，天津大学化工学院研究生刘咏的论文《抗生素杆菌肽锌脱色 提纯工艺研究》利用膜分离技术对杆菌肽锌盐进行纯化精制，最终可使产品效价提高到 50U/mg以上。这两种方法所获得产品的生物活性均不是很高。
[0006] 国外对该产品纯化工艺研究较多，US2,457,887以活性氧化铝或活性炭吸附杆菌 肽进行提取，由于无机介质对活性物质的吸附量很低，该法不适合工业化。US2，498，165和 US2，609，324使用大量有机溶剂多级萃取，有些溶剂毒性较大，该法收率较低，纯化效果也 不明显。US3,937,694以沉淀法纯化杆菌肽，但只提供了制备工艺中某一步的方法，未形成 完整制备药用产品的工艺。US2，739，063以沉淀剂将杆菌肽沉淀到无机载体上，该法收率较 低，产品稳定性差。GB782,999采用羧酸型阳离子交换树脂提取，解析液经溶媒萃取提纯后 制备杆菌肽锌，产品效价可到55U/mg，总收率35%左右，无论产品效价还是总收率均处于较 低水平。US2,915,432使用低交联度羧酸型阳离子交换树脂提取，辅以无机盐沉淀法纯化 制备出高效价杆菌肽锌总收率51%，产品效价可达76U/mg。该法需要使用大量无机盐，回收 困难，该法总收率也偏低。
[0007] 因此，如何制备得到杆菌肽以及杆菌肽锌盐，工艺简洁，收率高、低能耗、高活性而 且还要符合药典标准，成为发明人亟待解决的问题。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供一种操作简便、高活性的杆菌肽及其盐杆菌肽锌的制备方 法。
[0009] 本发明所提供的杆菌肽的制备方法，包括以下步骤： 1)吸附：向发酵液中加入超顺磁性微球。
[0010] 2)分离:磁性分离发酵液中的超顺磁性微球，收集分离出的超顺磁性微球。
[0011] 3)清洗:用水清洗分离出的超顺磁性微球。
[0012] 4)洗脱：以解吸液浸泡分离出的超顺磁性微球，收集该解吸液。
[0013] 5)萃取:将解吸液调PH6.0-8.0后以有机溶剂进行萃取，得杆菌肽萃取液。
[0014] 6)沉淀：向萃取液中加入沉淀剂沉淀，经过滤、干燥，得到杆菌肽。
[0015]其中步骤1)所述超顺磁性微球的粒径为1〇-30μπι，粒径分布为单分散，表面的功能 基团为羧基基团。所述的超顺磁性微球的用量为每升发酵液加入30-50克。
[0016]超顺磁性微球预处理及再生方式为每克微球加入3-5ml的2m〇L/L的HC1，静态浸泡 2-4小时后过滤，除去盐酸，然后用去离子水洗涤至pH值4.0-5.0。
[0017]其中步骤3)所述水为去离子水。
[0018] 其中步骤4)所述解吸液为2-4%氨水，用量为每克超顺磁性微球加入3-5毫升。
[0019] 其中步骤5)中所述有机溶剂为正丁醇、异丁醇、乙酸丁酯中的一种，萃取pH为6.0-8.0〇
[0020] 其中步骤6)所述沉淀剂为丙酮，用量为萃取液体积的5-8倍。
[0021] 本发明还公开了一种由杆菌肽制备杆菌肽锌的制备方法，所述方法由步骤1)到步 骤5)制得的萃取液加入水，加酸化剂调节pH为3.0-5.0,萃取得水相，水相调节pH为7.5-9.0，向水相中加入硫酸锌，得到杆菌肽锌沉淀，经过滤、干燥制得。
[0022] 其中优选加酸化剂调节pH为3.5-4.0,其中所述酸化剂为盐酸、草酸、醋酸、硫酸中 任意一种。
[0023] 其中萃取得到的水相调节pH为8.0-8.5。
[0024] 本发明由于超顺磁性微球对杆菌肽活性组分具有高特异性吸附，对无活性的杆菌 肽F吸附能力很弱，不仅有效除去了微生物发酵代谢中产生的杂蛋白、色素、多糖等杂质，特 别是将难以通过简单方法去除的杂质杆菌肽F含量有效降低，从而大大简化了提取纯化工 艺。该工艺由于操作简单快捷、处理时间短，有效减少了活性组分的降解，杆菌肽的纯度大 幅提高，各种活性组分得到很好的保留，各组分比例达到美国药典标准。所制备的杆菌肽生 物效价到达78U/mg，杆菌肽锌生物效价到达76U/mg，杆菌肽锌总收率可达70%以上。工艺中 所用溶剂毒性小、用量少，易回收利用，方便工业化生产。 具体实施例
[0025] 下述实例仅用于阐述实现本发明的方法，不应理解为对本发明的限制。所有基于 本发明思路做出的修改和变化都应归于本发明的保护范围。
[0026] 实施例中所用的实验材料如无特殊说明均为工业级原料;所用的超顺磁性微球由 苏州纳微生物科技有限公司提供，所用的棉籽蛋白粉购自青岛科瑞，酵母浸提物购自安琪 酵母股份有限公司；分析色谱柱Hypersil GOLD C18,5ym，4.6X250 mm购自迪马科技有限 公司，提取过程所用有机溶剂购自北京化工厂，酸、碱、硫酸锌等试剂均为市售。色谱溶剂购 自霍尼韦尔贸易(上海)有限公司。
[0027] 杆菌肽发酵液制备方法 地衣芽孢杆菌菌株种子液的制备 将地衣芽孢杆菌菌株的斜面培养物接种于种子培养基，30°C、200rpm、培养20h获得种 子液。
[0028] 其中所述的种子培养基按以下方法制得:玉米淀粉5.0克、葡萄糖10.0克、酵母粉 10.0克、硫酸铵2.0克、氯化钠2.0克、七水硫酸镁1.5克，加自来水定容至1000mL，pH7.0,121 °C灭菌30分钟。
[0029]本发明所述杆菌肽产生菌为编号ATCC 10716的菌株。
[0030]发酵培养基组成： 玉米淀粉30.0克、葡萄糖20.0克、棉籽蛋白粉15.0克、酵母粉15.0克、硫酸铵2.0克、玉 米浆4.0克、磷酸二氢钾1.5克、氯化钠2.5克、七水硫酸镁2.0克，加自来水定容至IL，pH6.8， 121°C灭菌30min，发酵罐发酵培养。
[0031 ] 发酵条件：种子培养20小时后接种，接种量为6%，罐温29 °C、罐压0.05 ±0.01 Mpa、通气比1:1.2 vvm，400 rpm搅拌，发酵96小时。
[0032]超顺磁性微球预处理及再生 超顺磁性微球预处理及再生方式为每克微球加入3-5ml的2m〇L/L的HC1，静态浸泡2-4 小时后过滤，除去盐酸，然后用去离子水洗涤至pH值4.0-5.0。
[0033] 实施例1 取杆菌肽发酵液500ml，发酵单位765U/ml，向