一种牙鲆cd59抗菌肽的重组表达和纯化复性方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于抗菌重组蛋白技术领域，具体涉及一种牙鲆⑶59抗菌肽的重组表达和 纯化复性方法。
【背景技术】
[0002] 海水养殖鱼类长期生活在富含微生物的水环境中，非特异性免疫系统是其抵抗外 来病菌侵染的重要屏障（Hikima, J. I · ,Minagawa,S. ,Hirono，I ·，&Aoki ,T· 2001 .Molecular cloning，expression and evolution of the japanese flounder goose-type lysozyme gene,and the lytic activity of its recombinant protein. .Biochimica Et BiophysicaActa，1520(1 ),35-44.) 补体系统是非特异性免疫的组成部分之一，它在抵抗 病原微生物入侵、清除抗原抗体复合物及衰老凋亡的细胞、连接特异性免疫与非特异性免 疫方面发挥至关重要的作用（Walport，M.J.(2001).Complement.first of two parts..N Engl J Med，344(14)，1058-1066.h终末裂解途径是调节补体激活以保护机体自身免受补 体损伤过程中的一个关键步骤，其中CD59是唯一鉴定出来的、目前研究最为清楚的在终末 裂解途径中起作用的膜蛋白，也是表达量最多的膜补体调节蛋白（Miwa，T.，&Song， ff.C.2001.Membrane complement regulatory proteins: insight from animal studies and relevance to human diseases..International Immunopharmacology，1(3)，445_ 459·)。
[0003] CD59是一个分子量小且广泛分布的球状糖蛋白，它的主要形式是通过糖基化磷酯 酰肌醇（GPI)锚定在细胞膜的外层（Meri，S. ,Waldmann，H.，&Lachmann， P.J.1991.Distribution of protectin(cd59)，a complement membrane attack inhibitor, in normal human tissues..Laboratory investigation；a journal of technical methods and pathology，65(5) ,532-537. )dCD59的主要功能是在补体的终末 裂解途径上抑制膜攻击复合体(MAC)的组装，并且是在MAC组装的最后阶段通过防止C9结合 至丨JC5b_8复合体上来发挥抑制作用（Imre，F.，Lajos，B. ,Yasushige，I · ,Noriko，0·，Csaba， B.，&Denes，B.，et al.2002.Cd59 blocks not only the insertion of c9 into mac but inhibits ion channel formation by homologous c5b_8 as well as c5b-9..Journal of Physiology，539(Pt2) ,537-545.)。已有研究表明，斑马鱼、尼罗罗非鱼CD59基因原核表 达的重组蛋白分别具有抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和无乳链球菌的活性（Chen，S.， JiejW.,LiujS.,LijH.,&Zhang,S.2013.Zebrafish cd59 has both bacterial-binding and inhibiting activities .Developmental&Comparative Immunology ,41(2),178-188.;Gan，Z.，Wang，B.，Zhou，W.，Lu，Y.，Zhu，W.，&Tang，J.，et al.2015.Molecular and functional characterization of cd59 from nile tilapia(oreochromisniloticus) involved in the immune response to streptococcus agalactiae..Fish&Shellfish Immunology,44(1),50-59.)〇
[0004] 抗菌肽(AMPS)是一类广泛存在于自然界生物体中的小肽类物质，是各类有机体非 特异性免疫防御系统的重要组成部分（￥11，!1.，!1.1^，0.6&〇，(：.6&〇311(1^!.^^ 2015.Secretory Production of Antimicrobial Peptides in Escherichia coli Using the Catalytic Domain of a Cellulase as Fusion Partner.Journal of Biotechnology，214:77-84)。抗菌肽具有较好的热稳定性，具有广谱抗菌活性，且抑菌效果 显著，对防护的物种和环境无毒无害，是一种纯天然绿色的生物活性物质，应用前景广阔。 但自然界中天然存在的抗菌肽资源匮乏，提纯困难。而化学合成方法成本高，价格贵，由此 限制了抗菌肽的广泛应用。近年来，水产养殖业大量使用抗生素以提高水产品的产量，但由 此带来的问题不断。一方面，长期使用抗生素使其在水产品体内积累，使产品质量下降的同 时也给消费者带来健康威胁;另一方面，单纯使用抗生素极易使致病菌产生耐药性，效果减 弱的同时污染养殖水环境。而抗菌肽的靶位点主要为致病菌细胞膜，对真核生物几乎无影 响，不易产生抗性且对环境友好。因此利用生物工程手段大量制备高效抑菌的抗菌肽并投 入到生产中，已为水产养殖业或畜牧业的健康发展提供新的可能。
[0005] 但是CD59抗菌肽分子量小，纯化相对困难;碱性氨基酸多，在水溶液中易以自由卷 曲的形式存在，同时缺乏辅助其正确折叠的分子伴侣，因此常常需要复性过程。这些因素都 限制了抗菌肽在生产中的大规模应用。因此，选择适当的表达载体、筛选大量表达有活性抗 菌肽的工程菌株、摸索合适的纯化复性条件及降低生产成本对于抗菌肽的大规模生产及推 广使用至关重要。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种牙鲆⑶59抗菌肽的重组表达及纯化复性的方法。
[0007]本发明首先提供一种编码牙鲆CD59抗菌肽的核酸片段，其序列为SEQ ID N0:2;
[0008] 本发明另一个方面提供一种用于重组表达牙鲆⑶59抗菌肽的方法，包括如下的步 骤：
[0009] 1)重组质粒的构建
[0010] 将携带有牙鲆CD59抗菌肽的核酸编码片段的PMD18-T质粒与pET32a( + )质粒均用 EcoRI和XhoI双酶切后，酶切产物分别回收，并进行连接，得到用于表达序列为SEQ ID NO: 1 的牙鲆CD59抗菌肽的重组质粒；
[0011] 2)重组蛋白的诱导表达
[0012] 将步骤1)制备的重组表达载体转化进宿主菌BL21(DE3)pLysS中，用含抗生素的LB 培养基扩大培养后，在添加有抗生素的LB平板中培养，进行PCR反应，筛选转化入重组表达 载体的BL21(DE3)pLysS工程菌株；
[0013] 所述的引物的序列信息如下：
[0014] PU'-GAATTCCTGACGTGCAACTACTGTTACTCH^ (SEQ ID N0:3)、
[0015] P2:57-CTCGAGTAATGGCGCCAAGCTGAGGTG-37(SEQ ID NO:4)；
[0016] 所述的抗生素为氨苄青霉素与氯霉素；
[0017] 将挑取的工程菌株单克隆接种于LB培养液中37°C培养过夜;将活化菌接种于2 X YT培养液中，37°C震荡培养，当0D600为0.6左右时加诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG)至终浓度ImM，37°C诱导表达3h，菌液经12，OOOrmp，离心10min收集细胞；
[0018] 3)重组蛋白的分离纯化
[0019] 将收集的细胞加入裂解液（1^8-此15〇111]\^0了4 2〇111]\1，他(3110〇111]\1，1>^〇11-1000.5 % )重悬细胞，并超声波破碎细胞，12000rmp，离心10min收集裂解上清及沉淀;将包 涵体蛋白用8M尿素溶解后过Ni柱纯化；
[0020] 4)重组蛋白的复性
[0021 ] 将透析袋用NaHC03/EDTA溶液（IOmM NaHC03，lmM EDTA)煮沸处理，用灭菌三蒸水 洗涤透析袋;将要复性的重组蛋白浓度用溶解液稀释到0. lmg/ml-0.2mg/ml;将其转入透析 袋中，将提前预冷的透析液I倒入烧杯中，将装好的透析袋放入烧杯并将烧杯移入冰盒中， 放到磁力搅拌器上慢速搅拌，冰浴透析12h;
[0022] 将透析袋移至提前预冷的透析液II中，冰浴搅拌透析12h;
[0023] 将透析袋移至提前预冷的透析液III中，冰浴搅拌透析12h;
[0024] 将透析袋移至提前预冷的透析液IV中，冰浴搅拌透析12h;
[0025] 将透析袋移至提前预冷的透析液V中，冰浴搅拌透析12h;