石油脱硫脱氮菌株及其脱硫脱氮的基因与应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及微生物菌株及环境微生物领域，具体设及一株石油脱硫脱氮热葡糖巧 地芽抱杆菌W-1及其降解基因与应用。
【背景技术】
[0002] 21世纪是环保世纪，作为化学工业主力军的能源工业在环保和工艺方面都面临许 多挑战和机遇，并由此诞生了生物化工和环保领域交叉的一口新兴学科。随着全球工业化 进程的迅猛发展，对能源的需求量剧增，目前，世界能源结构中石油所占比例最大，为 37.4%。石油产品中存在硫、氮化合物，应用含有硫、氮化合物本产品，会对环境造成污染，对 设备产生腐蚀。因此，脱硫、脱氮技术是石化工业及环境保护的重要研究课题。
[0003] 石油及其产品深度脱硫是我国乃至全世界石油化工领域在新世纪面临的重要课 题。石油中的硫主要W硫醇、硫酸、嚷吩、苯并嚷吩(BT)及他们的烷基取代物和衍生物等有 机硫化物的形式存在，运些化合物在燃烧时产生大量的硫氯化物，带来多种危害。其中最为 严重的是燃烧所产生的S〇2和S〇3极易与大气中的水蒸气化合形成酸雨，造成严重的污染，破 坏生态平衡，危害人体健康（MonticelloDJ.desul化;rizationoffossil化els.Ann Rev Microbiol. 1985,39:371~389)。近年来，随着生物技术脱硫越来越为人民所关注。生物 催化脱硫(BDS)是一种在常溫常压下利用需氧、厌氧菌除去石油含硫杂环化合物中结合硫 的一种新技术，其利用微生物特有的酶W生化裂解的方式将化石燃料中硫除去，是在常溫 常压和不需要氨气的条件下进行，能专一性切断碳硫键而使化石燃料中的硫W硫酸盐的形 式释放出来，其目的是利用自然界存在的微生物脱除硫而不破坏有机燃料价值的控类。其 特点是工艺成本低，能耗省，流程简单，反应条件溫和，环境清洁，符合生态环境友好的发展 趋势。BDS技术从出现至今已发展了几十年，目前为止仍处于开发研究阶段。生物催化 脱硫技术为石油中有机硫组分的去除，开辟了一条新的途径。
[0004] 石油中氮含量一般比硫含量低，质量分数通常在0.05%~0.5%范围内，仅有少数原 油的氮含量分数超过0.6%。我国原油中氮含量偏高，且大多数原油的渣油中浓集了约90%的 氮，因此加工我国原油时，对原油中的氮含量应倍加关注。原油中有机氮化物的存在对炼油 工艺、石油产品和环境都有很大危害。虽然原油中氮化物的数量和种类没有硫化物多，但它 的影响要大于硫化物。在油品生产中，极微量的有机氮化物就可引起催化裂化、加氨精制等 工艺过程中贵重催化剂中毒，缩短催化剂的使用寿命，从而增加了生产成本，减少产量。据 统计，减少原油中氮含量的90%，能提高20%的汽油产量，还能减少设备腐蚀，降低费用。另 夕h氮化物会影响油品的颜色和安定性，特别是在储存过程中，氮化物的存在会导致油色变 深及产生胶质和沉淀;氮化物的燃烧会生成腐蚀性很强的酸性气体，W氮氧化物Μ)χ的形式 排入大气，造成严重的空气污染，并形成酸雨。因此，脱除石油中的氮显得尤为重要，而传统 生物脱氮技术存在各种各样的不可忽视的缺点：成本高、操作难度大、脱除底物种类有限、 脱除效果不显著，并且已有的相关脱氮微生物的研究报道几乎全为常溫微生物。
[000引本发明的菌株属于嗜热菌株，具有同时对石油脱硫脱氮的作用，可W应用到石化 产业、环境保护业和其他相关工业生产中。
【发明内容】
[0006] 本发明的主要目的在于提供一种热葡糖巧地芽抱杆菌W-1 (Geobacillus 1：1161'1]10旨111(3031(1日3；[113)及其鉴定和应用，其鉴定的菌种属于±壤芽抱杆菌属，耐高溫，具有 很好的热稳定性能，可W在发酵等需要热稳定酶条件的工业生产中应用；能有效脱除石油 中含硫(氮)化合物中硫(氮），w及该菌株在含硫(氮)的原油及其馈分脱硫脱氮中的应用。
[0007] 本发明的第二个目的是提供该菌株的鉴定特征和16S rRNA序列。
[0008] 本发明的第Ξ个目的是提供该菌株脱除含硫含氮化合物中硫元素、氮元素的方 法。
[0009 ]本发明应用于石油生物深度脱硫脱氮过程。
[0010]本发明的技术方案概述如下： 本发明所提供的热葡糖巧地芽抱杆菌，其特征在于：该菌株为Geobacillus thermoglucosidasius，2015年12月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中屯、（China General Microbiological Cultuer Collection Centre)进行保藏，保藏地 址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101,登记入 册编号为CGMCC N0.11780。
[00川 （1)该菌株已从大港油田地层水样中分离纯化得到，经全基因测序，16S rDNA注释 属于Geobacillus thermoglucosidasius。该菌是革兰氏阳性菌，生物学特性为接触酶阳 性，体形态为有芽抱长杆菌，菌落呈圆形，乳白色，稍隆起，外形光滑，边缘整齐，湿润，不透 明；能水解明胶、淀粉和酪蛋白；能还原硝酸盐和亚硝酸盐；不能利用巧樣酸盐；高于3%的 NaC 1其生长受到抑制。通过对该菌基因组的测序，发现该菌含有很多与石油脱硫脱氮相关 的基因。该菌的最适生长条件为:溫度60-65°C，pH=7.0~7.5，菌落形态如图1。
[0012] (2)用ABI 50 C皿/E鉴定试剂条对该菌株利用不同碳源进行产酸试验，结果显示 该菌株能利用核糖、D-木糖、1^-阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖、果糖、甘露醇、N-乙酷葡萄糖胺、 纤维二糖、麦芽糖、薦糖、海藻糖、:t仑糖，不能利用甘油、D-阿拉伯糖、山梨醇、乳糖等发酵 产酸。
[001引 （3 )通过对Geobac i 1 lus thermog lucos i das ius进行全基因测序发现， Geobacillus thermoglucosidasius具有许多与脱除含硫含氮化合物中硫元素的相关基因 (参见表1)、氮元素的相关基因（参见表2)，运些基因对于石化产业及环境保护方面的去硫 去氮有重要意义。
[0014] 表1 W-1基因组中与脱硫相关的基因
所述与脱除硫相关的基因参见表1 表2 W-1基因组中与脱氮相关的基因
所述与脱除氮相关的基因参见表1 核巧酸序列SEQ ID No.2:
AGCAAACGATCCGCAGGCGATGTCTTTATGGGCCGGGCAAGGATATCGCTTGGCGAAAGATATGCCGGCTGGAGAGA TTGTACAGTTGTTAATGAAGGAATTGAGAGAGATGGTGAATAAATAG 本发明采用活体细胞处理法处理高硫柴油、劣质油浆;采用微库伦法测定经该菌处理 前后石油中的硫和氮的含量。结果表明： (l)W-l菌株脱除石油中硫和氮有显著效果。
[001引（2巧经W-1菌株处理的高硫柴油中所含硫含量为2.15%，氮含量为0.57%，经W-1菌 株处理后硫、氮含量分别为0.53%、0.25%。
[0016 ] (3巧经W-1菌株处理的劣质油浆中所含硫含量为1.82%，氮含量为0.79%，经W-1菌 株处理后硫、氮含量分别为0.72%、0.32%。
[0017]
【附图说明】： 图1为W-1的菌落形态图。
[0018] 【具体实施方式】： 下面结合实施例说明本发明，运里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专业人 员按照本发明的精神可W对其进行改进和变化，所述的运些改进和变化都应视为在本发明 的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定;其中所用试剂均有市售； 本发明所用到的菌株来源： 实施例1:
(一)热葡糖巧地芽抱杆菌W-1的提取方法 现场采集大港油田水样，采用水样加入1%石油在60°C 18化/min条件下进行富集培养。 一周后，在固体LB培养基(蛋白腺1 Og/L、酵母粉5g/L、氯化钢1 Og/L、琼脂粉15g/L，化0H调抑 至7.0，12rC、20min高压灭菌，待溫度降到55°C时(手可触摸），倒入培养皿中，获得固体LB 培养基）