用于分离淋巴细胞的组合物及其分离液的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，尤其设及一种用于分离淋己细胞的组合物及其分离 液。
【背景技术】
[0002] 密度梯度离屯、法(Density Gradient Cenhi化gation)作为一种传统的分离技 术，用于细胞分离已经存在了半个世纪。基于密度梯度离屯、法的细胞分离介质产品即细胞 治疗辅料，将待分离的血液样品平铺于分离介质上，接着对其在恒定溫度下进行低速离屯、。 样品中各细胞群将由于密度差异分布在离屯、管的不同部位，例如，如果分离介质具有与目 标细胞群相同的密度，目标细胞将富集在分离介质层与样本层的交界面，用吸管将该层细 胞吸出就达到了对目标细胞群的分离。
[0003] 淋己细胞作为一种效应细胞，广泛存在于人外周血液、骨髓或人厮带血中。高纯度 的淋己细胞的获取对于疾病的细胞学诊断、成分输血、治疗用细胞产品的制备等具有非常 重要的意义。淋己细胞分离介质是具有恒定密度、渗透压及pH值的混合体系。
[0004] 目前，商品化的淋己细胞分离介质WFicoll 400(聚薦糖400)和泛影酸钢为主要 成分，密度在 1. 〇73g/cm3和 1.084g/cm3之间，渗透压在280m0smol/kg和310m0smol/kg之间， pH在6和9之间。为了提高产品的技术标准W适应细胞治疗特殊行业要求，目前很多研究者 都在试图改进分离介质的组成W用于临床治疗用途。
[0005] 除法规因素外，产品特性不明确是限制其临床使用的另一个重要因素。在淋己细 胞的工业化生产过程中，细胞分离介质是仅次于培养基外，与细胞接触时间最久的外源物 质。在标准的分离过程中，细胞必须与分离液接触15-45分钟的时间，W达到最佳分离效果。 在运段时间内，分离液中各组分可能通过被动扩散、细胞的主动运输、胞吞/胞饮作用、表面 黏附等途径，在细胞内部蓄积，且此部分蓄积成分，很难通过常规的洗涂从分离得到的目标 细胞(例如淋己细胞）中完全去除。尽管常规理化指标及菌落、内毒素等生化指标外已达到 较高标准，但原料组分的不确定性给细胞分离介质的临床应用带来了极大的障碍。例如， Ficoll 400并无临床应用，其毒理学、药物代谢动力学特性均没有相关数据支撑。Ficoll 400在分离中不表现出对细胞的毒性，但化学品安全说明书(MSDS)中的数据显示，慢毒试验 中Ficoll 400表现出一定毒性，包括恶屯、、呕吐、头痛甚至昏迷，皮肤严重红肿、水肿等。
[0006] 曾有研究者使用右旋糖酢代替Ficoll 400,提高了一定的安全性，并使用径乙基 淀粉提高分离效率。虽然径乙基淀粉化y化oxyethyl S化rch)是复方制剂，但长期大剂量使 用径乙基淀粉，患者会出现皮肤痊痒。严重肝脏疾病或严重凝血功能素乱的病人应慎用。使 径乙基淀粉在临床中的应用受到限制。
[0007] 因此，有必要提供一种既能保证安全性又能保证分离效率、纯度的淋己细胞分离 液。
【发明内容】
[0008] 本发明要解决的技术问题是提供一种既能保证安全性又能保证分离效率、纯度的 价格便宜的用于分离淋己细胞的分离液及其分离方法。
[0009] 为解决上述技术问题，本发明提供技术方案如下：
[0010] -方面，提供一种用于分离淋己细胞的组合物，由W下原料按重量份组成： 右旋糖胖 I~4份 海藻糖 4~6份
[00"] 超低拇度海藻酸钢 0.3~1.5餘 泛影葡胺 4~7份 L-甲疏氨酸 0.003-0.006份 L领氨聽 化008 -0.011份
[0012] 以亮氨酸 0佩-0.012份。
[0013] 所述右旋糖酢与海藻糖的比例范围为1:1~1:4,优选为1:2。
[0014] 本发明配方中的全部原料均符合静注级原料药标准，原料不确定性小，安全性高， 并且分离后的淋己细胞具有较好的杀肿瘤活性;本发明的组合物可配成生理溶液状态的分 离介质，对血液样品进行离屯、处理后，淋己细胞与单核细胞将在分离介质和血浆的交界面 形成比较明显的云雾状细胞条带，而红细胞、粒细胞等其他细胞在离屯、力及本发明组合物 的作用下分布在离屯、管底和分离介质层;本发明采用的右旋糖酢(Dex化an)是一种分支化 的葡聚糖，其通过一些乳酸菌合成，典型地包括串珠菌和变形链球菌。临床上常用的有中分 子右旋糖酢，主要用作血浆代用品；海藻糖又称漏芦糖、葦糖等，是一种安全、可靠的天然糖 类；由两个葡萄糖分子Wl，l-糖巧键构成的非还原性糖，对多种生物活性物质具有非特异 性保护作用，对单个核细胞起到一定的保护作用;超低粘度海藻酸钢具有较低的粘度，较多 的径基有助于红细胞的沉淀;1^-甲硫氨酸、1^-鄉氨酸鄉氨酸在保持淋己细胞活性的基础 上对提高分离淋己细胞分离率也具有一定的帮助。
[0015] 进一步地，所述组合物由W下原料按重量份组成： 右旋糖師 1.5~3.5份 海藻糖 4.5~5.5份 超低拇度海藻酸納 0 3~I翁
[0016] 泛聲霸胺 4~6餘 心甲硫氨酸 0.004-0.005份 心额氨酸 0.009-0.01份 心亮氣酸 0.01-0.012份。
[0017] 进一步地，所述组合物由W下原料按重量份组成： 右旋糖野 2~3份
[001引海藻糖 4.8~5.2徐 超低拇度海藻酸銷 0.4~0.8份 泛影葡胺 4~5徐 ：L-甲硫氨酸 0.004-0.005份
[0019] L缔氨酶 0.009-0.0]份 心亮氨酶 0.0!-0.0 ? 2份。
[0020] 进一步地，所述组合物，由W下原料按重量份组成： 右旋糖師 2.5餘 海藻糖 5份 超低枯度海藥醜銷 0.6份
[0021] 泛影葡胺 4J份 心甲硫氯醜 0.005份 L-绩氨酸 0.01份 L-亮氯酸 0.0Π 份。
[0022] 优选地，所述右旋糖酢为Dextran70。
[0023] Dextran70的斯托克斯半径为5.8加1，临床常用的制剂为6%中分子右旋糖酢含 0.9%氯化钢制剂，平均分子量为70kD(60kD~lOOkD)，分子量最接近血浆蛋白的重量。其分 子的大小范围较广，排出复杂，在血管内半衰期约6~化。它能从组织中吸收水分，适用于补 充血容量，6 %右旋糖酢500ml可增加血浆容量450~500ml，其扩容作用可持续4h (5~化）。 临床上主要用于防治低血容量性休克，失血量在总血容量20% W内者可全部用右旋糖酢作 补充，不需输血。
[0024] 优选地，所述单个细胞为单核细胞或淋己细胞。
[0025] 另一方面，提供一种用于分离淋己细胞的分离液，含有权利要求1-5任一所述的组 合物和水，所述分离液的密度为1.070~1.090g/cm 3,渗透压为275~300smol/kg，pH为6~ 9,粘度为3.0~5.Ocp。
[00%]进一步地，所述分离液为无菌状态。
[0027]再一方面，提供一种分离样品细胞的方法，包括如下步骤：
[00%]步骤1:将上述的分离液加入离屯、管，所述分离液的体积不大于离屯、管体积的1/2;
[0029] 步骤2:将抗凝剂处理过的样品经平衡盐溶液或无血清培养基稀释后铺在所述分 离液上，在8-25°C，200g-800g，10~30min条件下离屯、。
[0030] 进一步地，所述步骤2的稀释比例为1:2-2:1。
[0031] 优选地，所述步骤2的稀释比例为1:1-1.5:1。
[0032] 综上所述，本发明的有益效果表现为：
[0033] 本发明配方中的全部原料均符合静注级原料药标准，原料不确定性小，安全性高， 并且分离后的淋己细胞具有较好的杀肿瘤活性;本发明的组合物可配成生理溶液状态的分 离介质，对血液样品进行离屯、处理后，淋己细胞与单核细胞将在分离介质和血浆的交界面 形成比较明显的云雾状细胞条带，而红细胞、粒细胞等其他细胞在离屯、力及本发明组合物 的作用下分布在离屯、管底和分离介质层;本发明采用的右旋糖酢(Dex化an)是一种分支化 的葡聚糖，其通过一些乳酸菌合成，典型地包括串珠菌和变形链球菌。临床上常用的有中分 子右旋糖酢，主要用作血浆代用品；海藻糖又称漏芦糖、葦糖等，是一种安全、可靠的天然糖 类；由两个葡萄糖分子Wl，l-糖巧键构成的非还原性糖，对多种生物活性物质具有非特异 性保护作用，对单个核细胞起到一定的保护作用;超低粘度海藻酸钢具有较低的粘度，较多 的径基有助于红细胞的沉淀;1^-甲硫氨酸、1^-鄉氨酸鄉氨酸在保持淋己细胞活性的基础 上对提高分离淋己细胞分离率也具有一定的帮助。
【具体实施方式】
[0034] 为使本发明的实施例要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合 具体实施例进行详细描述。但本发明绝非限于运些例子。W下所述仅为本发明较好的实施 例，仅仅用W解释本发明，并不能因此而理解为本发明专利范围的限制。应当指出的是，凡 在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保 护范围之内。因此，本发明专利的保护范围应W所附权利要求为准。
[00对实施例一
[0036] 在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20°C下，将符合药用标准的右旋糖酢 Ig，海藻糖4g，超低粘度海藻酸钢1.5g，泛影葡胺4g，1^-甲硫氨酸0.006g，k鄉氨酸0.008g和 k亮氨酸0.0 lg充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液lOOmL，再经过0.22皿滤膜过滤至 一支无菌、无内毒素的容器内。
[0037] 实施例二
[0038] 在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20°C下，将符合药用标准的右旋糖酢 4g，海藻糖6g，超低粘度海藻酸钢0.3g，泛影葡胺7g，1^-甲硫氨酸0.003g，k鄉氨酸0.01 Ig和 k亮氨酸〇.〇12g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液lOOmL，再经过0.22皿滤膜过滤 至一支无菌、无内毒素的容器内。