一种球化酶技术固定化腈水合酶的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于固定化酶领域，特别是一种球化酶技术固定化腊水合酶的方法。
【背景技术】
[0002] 与传统的化学催化相比，酶催化具有溫和的转化条件、高的反应速率、优异的选择 性等优点，催化过程具有能耗低、物耗少、环境友好等优点。在大力倡导流程工业绿色化、节 能减排的新形势下，酶催化将在大宗化学品、精细化学品的工艺取代W及环境化学等方面 发挥日益重要的作用。但由于W下方面的约束，限制了酶催化更广泛的应用：（1)脱离了细 胞内的微环境，酶在细胞外对溫度和抑耐受范围窄、适应性差、易失活等；（2)酶提取纯化的 费用较高，而在应用过程中重复利用率低、操作稳定性差、造成酶催化成本较高；（3)对非天 然底物的催化活性低。因此，如何最大限度地提高酶在胞外环境中的活性和稳定性、使其更 有效的适应非生理催化环境、实现高效催化是新一代工业生物催化技术发展的重要课题。 其中采用新颖的固定化酶技术、改造和发展高效固定化酶催化剂是解决W上问题的重要途 径。
[0003] 球化酶(S地erezyme)技术是一种无载体固定化酶技术。首先将含有酶的水相分散 在含有活性剂的油相当中进行，形成了油包水的乳液，运个过程称为乳化;然后加入交联 剂，使得蛋白分子之间通过交联剂连接稳定成球，经过交联的过程得到球化酶，如图1所示。 由于运种技术是在交联酶聚集体技术的基础上发展而来，在具备交联酶聚集体技术的所有 优势的同时，也在一定程度上克服了其粒径不可控，机械强度差等缺点，具有较高的比酶 活。球化酶在水油两相中形成，可W在一定程度上影响酶的方向，有利于酶在两相界面上定 位。球化酶技术形成的是粒径可控的球状结构，有利于固定化酶在反应体系中的分散，且球 状结构拥有较大的比表面积更利于固定化酶与底物接触反应。同时，球化酶的制备过程简 单，成本低廉。Brady等采用的球化酶技术，是将乳化法与交联酶聚集体技术结合制备出 0.5-10WI1的脂肪酶微球，此微球可进一步团聚形成100M1左右的团聚体，在一定程度上实现 了无载体固定化酶的可控制备，但由于该方法采用的是传统的乳化技术，乳液液滴和固定 化酶微球可控制备性差。因此本发明采用新的乳化方法---膜乳化技术，W此为基础，利用 球化酶技术对腊水合酶进行固定化。
[0004] 腊水合酶(Nitrile hydratase，EC 4.2.1.84)是一种可^将腊类物质转化为酷胺 类物质的酶，例如:在全细胞或者游离的腊水合酶的催化作用下，丙締腊可W转化为丙締酷 胺;3-腊基化晚可W转化为烟酷胺。酷胺类物质在有机合成、医药、农药等方面有着十分重 要的应用。同全细胞相比，游离的腊水合酶更受青睐，因为它具有严格的化学、区域和对映 选择性及底物专一性。但是，游离酶的使用通常会因为价格昂贵，溫度、pH和操作稳定性低， 难W回收利用等因素受到限制。将游离酶进行固定化可W在一定程度上提高酶的耐受性， 并且能够循环使用，方便下游过程的操作。目前报道的腊水合酶固定化技术主要包括交联 酶聚集体技术、溶胶-凝胶包埋技术等。同交联酶聚集体技术相比，球化酶可控性更强，分散 性更好;同有载体固定化酶方法相比，球化酶技术成本低廉。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是针对当前技术的不足，提供一种操作简单、成本低廉的固定化腊 水合酶的方法。该方法W膜乳化为基础，采用球化酶技术对腊水合酶进行固定化。膜乳化是 在一定的压力下，将分散相通过微孔膜分散到连续相中，由膜孔径来控制而呈单分散性，和 传统乳化方法相比，具有能耗低、制备条件溫和、粒径大小及分布可控、制备的乳液稳定性 和重复性好等优点。另外，膜乳化的设备工艺简单易行，易于规模化，因而近年来被广泛关 注。对于球化酶而言，粒径均一、粒度可控是保证其得到很好应用的前提。该方法固定化酶 制备工艺简单，酶活损失小，且固定化效率较高。
[0006] 本发明的技术方案是：
[0007] -种球化酶技术固定化腊水合酶的方法，包括W下步骤：
[0008] (1)向腊水合酶溶液中加入保护剂化L，混合均匀作为水相；另向正己烧中加入表 面活性剂span-80，混合均匀作为油相;再把水相和油相混合揽拌制成粗乳液；
[0009] 其中，腊水合酶溶液的浓度为0.1~〇.5g/mL，P化的质量为腊水合酶溶液质量的 1 %~3% ; span-80的质量为正己烧质量的1 %~5% ;体积比为水相:油相=1:3~9;
[0010] (2)将上步得到的粗乳液在5~30kpa的跨膜压力下通过SPG膜乳化器，待粗乳液完 全通过SPG膜后，即得至ljW/0型（油包水)乳液，然后向该乳液中滴加交联剂戊二醒，在4°C下 交联0.5~4h，离屯、洗涂，即可得到球形腊水合酶粒子；
[0011 ] 其中，体积比戊二醒:W/0型乳液=1:60~90。
[0012] 本发明的有益效果是：
[0013] 1.本发明针对传统乳化法制备球化酶可控制备性差的缺点，将膜乳化技术应用到 球化酶的制备过程中，实现粒径均一的球化酶的可控制备。球形腊水合酶粒径分布在8-20μ m的范围内，呈现规则球状结构，分散性也比较好，如图3所示。
[0014] 2.本发明的制备工艺简单，条件溫和，酶活回收率在50% W上。重复使用10次后， 酶活还可达到初始酶活的45%左右。同游离酶相比，储藏稳定性也更好。
【附图说明】
[0015] 图1为球化酶的制备过程示意图。
[0016] 图2为膜乳化法制备球形腊水合酶的示意图。
[0017]图3为实施例帥球形腊水合酶的扫描电镜图。
【具体实施方式】
[0018] 本发明所述的球化酶的制备过程如图1所示：
[0019] 首先将含有酶的水相分散在含有活性剂的油相当中进行，形成了油包水的乳液， 运个过程称为乳化;然后加入交联剂，使得蛋白分子之间通过交联剂连接稳定成球，经过交 联的过程得到球化酶。
[0020] 具体实验中的膜乳化法制备球形腊水合酶的示意图则如图2所示。
[0021] 配制一定浓度的腊水合酶溶液，加入适量的保护剂和表面活性剂，取一定量的上 述溶液加入到适量的油相中，机械揽拌，制备乳化液;将制备的乳化液在一定的跨膜压力下 通过SPG膜乳化器，得到粒径均一的W/0型乳液；向此乳液中加入一定量的交联剂，揽拌一定 时间，静置;离屯、分离，洗涂，最终得到球形腊水合酶。
[0022] 本发明所使用的腊水合酶ES-NHT-118(初始酶活为5U/mg左右），购买自浙江宝赛 生物科技有限公司。