一种固定化茶叶过氧化氢酶的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明公开了一种固定化茶叶过氧化氢酶的制备方法，属于生物活性物质的分离提取技术领域。
【背景技术】
[0002]过氧化氢酶是一种除氧酶，又称触酶，是一类广泛存在于动物、植物和微生物体内的末端氧化酶，是以过氧化氢为底物，通过催化一对电子的转移而最终将其分解为水和氧气，其系统名称是Η2θ2:Η2θ2氧化还原酶，国际酶学委员会的编号为ECl.11.1.6。过氧化氢酶在食品工业中被用于除去用于制造奶酪的牛奶中的过氧化氢。过氧化氢酶也被用于食品包装，防止食物被氧化。在纺织工业中，过氧化氢酶被用于除去纺织物上的过氧化氢，以保证成品是不含过氧化物的。它还被用在隐形眼镜的清洁上:眼镜在含有过氧化氢的清洁剂中浸泡后，使用前再用过氧化氢酶除去残留的过氧化氢。过氧化氢酶在美容业中的使用:一些面部护理中加入了该酶和过氧化氢，目的是增加表皮上层的细胞氧量。
[0003]酶的纯化工作非常复杂，除了要保证纯度外，酶产品还必须保持其生物活性。纯化工艺必须能够每次都能产生相同数量和质量的酶，重复性良好。这就要求应用适应性非常强的方法而不是用能得到纯酶的最好方法去纯化酶。在实验室条件下的好方法却可能在大规模生产应用中失败，因为后者要求规模化，且在每日的应用中要有很好的重复性。
[0004]目前，国内外主要是从猪、牛等动物肝脏中提取纯化而得，如CN1436846提出了一种由动物肝脏中提取过氧化氢酶的方法，该方法经过将动物肝脏在酸性条件下粗提、高速离心、硫酸铵沉淀、热变性等四个步骤最后得到过氧化氢酶溶液，但是该方法中要用到大量的饱和度45 %的硫酸铵，在生产中容易造成大量无机盐的污染，不是环境友好型生产工艺，而且该方法得到的酶的活性不是很高，并只得到酶溶液而不是干品。
[0005]除此以外，现市售过氧化氢酶产品基本为动物肝过氧化氢酶和微生物过氧化氢酶共存，微生物发酵生产过氧化氢酶基本由国外知名大公司生产，市售价格较高，而且均不属于食品级过氧化氢酶。肝脏提取过氧化氢酶在国内已经工业化，但是传统提取工艺中加入有机溶剂和无机盐，使后续酶的纯化难度增加，产品纯度不高，酶活不稳定，得率低且生产周期长，除此以外传统干燥技术对酶蛋白破坏严重，生产产品也不属于食品级过氧化氢酶。
[0006]因此，通过改进传统生产工艺，最终得到产物得率高、酶活性稳定，且生产周期短、纯度高的食品级过氧化氢酶产品是很重要的。
【发明内容】
[0007]本发明主要解决的技术问题:针对目前传统的过氧化氢酶在提取的过程中需加入有机溶剂和无机盐，不仅造成了环境的污染，而且使得后续得到的酶活不稳定，得率低且生产周期长的现状，提供了一种通过从茶叶中提取过氧化氢酶，用甘三脂对其进行包覆固定化，从而得到固定化茶叶过氧化氢酶的制备方法。该方法不仅在制备过程中避免了无机盐的使用，是环境友好型生产工艺，而且制得的固定化茶叶过氧化氢酶活性稳定、得率高，可用于食品加工，具有很好的缓释效果。
[0008]为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是:
(1)称取100?200g新鲜茶叶用去离子水冲洗干净，沥干水分后用剪刀将其剪碎成I?3cm的碎片，放入2L玻璃瓶中，加入500?700mL pH为6?7的磷酸缓冲液和15?20g聚乙烯吡咯烷酮，放入高速匀浆机中，以20000?25000r/min的转速高速匀浆I?3min;
(2)匀浆结束后，将浆液移入烧杯中，放置在冰水浴中，在4?6°C下静置I?2h，并用注射器吸取150?200mL上层液体放入卧式离心机，以12000?15000r/min的转速离心5?15min，分离得到上清液，于4?6°C下保存；
(3)将上述得到上清液过凝胶柱进行过滤层析，用pH为7?8的磷酸缓冲液进行洗脱，洗脱流速为I?3L/h，收集层析洗脱液得到纯化后的过氧化氢酶母液；
(4)量取200?300mL乙酸乙酯装入500mL三口烧瓶中，加入50?60g三棕榈酸甘三酯和7?8g聚乳酸以及2?3g轻基乙酸，放入漩祸振荡器中，以10?20W的功率，300?500rmp/min的速率振荡乳化20?30min制得预乳液；
(5)将预乳液再移入超声乳化机中，加入10?20g卵磷脂，将50?70mL上述过氧化氢酶母液逐滴滴入混合乳液中，控制滴加速度使其20?30min内滴加完毕，以200?300W的功率超声乳化10?20min，制得双乳液；
(6)将上述制得的双乳液放入旋转蒸发器中，升温至80?90°C，旋蒸去除乙酸乙酯后得浓缩液，将其放入冷冻离心机中，在4?5°C下离心30?50min，离心转速为14000?16000r/min，分离得到固定化过氧化氢酶脂质体，用冷冻干燥机干燥后即得一种固定化茶叶过氧化氢酶。
[0009]本发明制得的过氧化氢酶为近乎白色至浅棕黄色的粉末;溶于水，不溶于乙醇、氯仿和乙醚;酶活达到11000U/mg以上;最适pH值为7.0?7.2。
[0010]本发明的应用方法是:在使用过程中，将本发明制得的固定化茶叶过氧化氢酶放入待制造奶酪的牛奶中，其中每I?3L牛奶中加入2?4g过氧化氢酶，充分混合，常温下静置I?3h即可。经检测，通过放入过氧化氢酶使得制造奶酪的牛奶中的过氧化氢得到了有效去除，去除率达到了85%以上。
[0011]本发明的有益效果是:
(1)本发明方法工艺简单，易于实施，便于推广；
(2)本发明所述方法提取得到的过氧化氢酶酶活至少达到11000U/mg以上，产品回收率达到25%以上，均高于现有的从动物肝脏中提取过氧化氢酶的方法，适合工业化生产的要求；
(3)本发明在制备过程中避免了无机盐的使用，是环境友好型生产工艺，具有较好的稳定性，最终制得的过氧化氢酶可用于食品加工，具有很好的缓释效果。
【具体实施方式】
[0012]首先称取100?200g新鲜茶叶用去离子水冲洗干净，沥干水分后用剪刀将其剪碎成I?3cm的碎片，放入2L玻璃瓶中，加入500?700mL pH为6?7的磷酸缓冲液和15?20g聚乙烯吡咯烷酮，放入高速匀浆机中，以20000?25000r/min的转速高速匀浆I?3min;然后匀浆结束后，将浆液移入烧杯中，放置在冰水浴中，在4?6°C下静置I?2h，并用注射器吸取150?200mL上层液体放入卧式离心机，以12000?150001'/111；[11的转速离心5?15111；[11，分离得到上清液，于4?6°C下保存;将上述得到上清液过凝胶柱进行过滤层析，用pH为7?8的磷酸缓冲液进行洗脱，洗脱流速为I?3L/h，收集层析洗脱液得到纯化后的过氧化氢酶母液;随后量取200?300mL乙酸乙酯装入500mL三口烧瓶中，加入50?60g三棕榈酸甘三酯和7?8g聚乳酸以及2?3g羟基乙酸，放入漩涡振荡器中，以10?20W的功率，300?500rmp/min的速率振荡乳化20?30min制得预乳液;接下来将预乳液再移入超声乳化机中，加入10?20g卵磷脂，将50?70mL上述过氧化氢酶母液逐滴滴入混合乳液中，控制滴加速度使其20?30min内滴加完毕，以200?300W的功率超声乳化10?20min，制得双乳液;最后将上述制得的双乳液放入旋转蒸发器中，升温至80?90°C，旋蒸去除乙酸乙酯后得浓缩液，将其放入冷冻离心机中，在4?5°C下离心30?50min，离心转速为14000?16000r/min，分离得到固定化过氧化氢酶脂质体，用冷冻干燥机干燥后即得一种固定化茶叶过氧化氢酶。
[0013]实例I
首先称取10g新鲜茶叶用去离子水冲洗干净，沥干水分后用剪刀将其剪碎成Icm的碎片，放入2L玻璃瓶中，加入500mL pH为6的磷酸