一种抗草甘膦转基因大豆及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及植物基因工程技术或育种领域，具体地，本发明设及转基因大豆及其 应用，更具体地，本发明设及一种抗草甘麟转基因大豆及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002] 大豆（Glycine max化.）.Merr)起源于中国，是世界上重要的油料作物和经济作 物，也是食用植物油与植物蛋白质的主要来源。杂草作为农业生态系统中的重要组成部分， 可W与作物竞争光、水、养分等资源，从而使作物减产。因此，大豆田间杂草的有效防除是大 豆稳产高产的关键因素之一。传统的人工除草包括手工拔草和使用简单农具除草等，耗时 耗力，功效低且不能大面积及时防除。化学除草剂的使用大大提高了农田杂草的防治效率， 但是传统除草剂如氯喀横隆、甲横隆等在±壤中残留严重、污染环境，限制了运些除草剂的 使用范围。
[0003] 草甘麟(Gly地osate)为内吸传导型、广谱灭生性除草剂，具有杀草谱广、高效、低 毒、无残留等优点，尤其对人畜毒害小，是全球应用范围最广的除草剂之一。草甘麟的作用 机制是通过不可逆地与植物体内EPSI^合酶(5-締醇丙酬酸莽草酸-3-憐酸合成酶)结合，阻 断植物和微生物体内莽草酸的代谢途径，从而导致植物体内代谢过程素乱，干扰蛋白质合 成，阻止次生产物的形成，最终使植株死亡;另一个重要的作用机理是抑制植物的光合憐酸 化。作为一种非选择性除草剂，草甘麟在杀灭杂草的同时也伤害大豆，因此通过转基因技术 培育抗草甘麟转基因作物，赋予作物抗草甘麟特性，是保护作物不受草甘麟伤害，提高杂草 综合防治效率的重要途径之一。已有的研究和转基因作物商业化发展历史证明大豆对草甘 麟除草剂的耐受性将是对于杂草防除、管理的有用性状。
[0004] 为赋予农作物草甘麟的耐受性，研究者集中于向植物体内导入能增加草甘麟耐受 性的基因，如EPSPS，EPSPS基因通常来自于微生物，其编码酶的结构特性使得草甘麟不能与 其结合，因而在草甘麟存在的情况下仍然能够保持了他们的催化活性(PCT/CN03/00651)。 当前全球商业化种植的草甘麟抗性转基因作物绝大多数为针对EPSI^所设计。
[0005] 在植物组织中N-乙酷转移酶(GAT)能够通过N-乙酷化作用使得草甘麟被有效的降 解，从而失去除草剂活性，且乙酷化的草甘麟不能与植物体内的EPSPS有效的结合，从而赋 予植物对草甘麟的耐受性(ZL 2005 1 0086626.X)。此外，由于草甘麟的降解，利用N-乙酷 化的手段培育转基因作物可W在植物整个生长周期都可W施用草甘麟，不受生长发育阶段 的限制。
【发明内容】
[0006] 本发明的一个目的是提供一种培育转基因大豆的方法。
[0007] 本发明提供的方法，为将外源DNA片段插入目的大豆基因组第19号染色体的第50， 543，767-50，543，792位间，替换掉第 19号染色体的第50，543，767-50，543，792位间24bp的 碱基序列，得到转基因大豆；
[0008] 所述转基因大豆的草甘麟抗性高于所述目的大豆；
[0009] 所述外源DNA片段为含有5-締醇丙酬酸莽草酸-3-憐酸合成酶基因和N-乙酷转移 酶基因的DNA分子。
[0010] 上述方法中，所述5-締醇丙酬酸莽草酸-3-憐酸合成酶基因为G2-aroA;
[00川所述N-乙酷转移酶基因为GAT;
[001^ 所述外源DNA片段为序列表中序列10或序列1自5'末端第6217-10855位核巧酸。
[0013] 上述方法中，所述外源DNA片段在所述转基因大豆的上游侧翼片段为所述目的大 豆基因组第19号染色体的自第50，543，767位核巧酸起向其上游方向延伸得到的长度为0至 5肺的任意一个DNA片段；
[0014] 所述上游侧翼片段具体为序列表中序列8所示的核巧酸；
[0015] 所述外源DNA片段在所述转基因大豆的下游侧翼片段为所述目的大豆基因组第19 号染色体的自第50，543,792位核巧酸起向其下游方向延伸得到的长度为0至5Kb的任意一 个DNA片段；
[0016] 所述下游侧翼片段具体为序列表中序列9所示的核巧酸。
[0017] 所述上游侧翼片段为所述转基因大豆基因组中紧邻所述外源DNA片段5'末端的片 段;所述下游侧翼片段为所述转基因大豆基因组中紧邻所述外源DNA片段3'末端的片段；
[0018] 上述方法中，所述外源DNA片段通过含有所述外源DNA片段的重组载体导入所述目 的大豆；
[0019] 所述重组载体的核巧酸序列具体为序列表中序列1。
[0020] 上述方法中，所述目的大豆为常规大豆品种化ck。
[0021] 由上述方法制备的转基因大豆也是本发明保护的范围。
[0022] 上述转基因大豆为T2代转基因大豆GE-J16纯合株系（命名为GE-J16)已于2015年 12月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、（简称CGMCC，地址:北京 市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No. 11686,分类命名为大豆Glycines max。
[0023] 本发明另一个目的是提供用于检测或辅助检测植物样品是否来源于上述方法制 备的转基因大豆或其后代或用于检测或辅助检测制品是否含有上述方法制备的的转基因 大豆或其后代的方法。
[0024] 本发明提供的方法，包括如下步骤:检测所述植物样品或其制品的基因组DNA中是 否含有DNA片段A，
[0025] 所述DNA片段A为如下1)或2):
[0026] 1)由权利要求3中的所述外源DNA片段在所述转基因大豆的上游侧翼片段、权利要 求3中的所述外源DNA片段和权利要求3中的所述外源DNA片段在所述转基因大豆的下游侧 翼片段组成；
[0027] 2)与1)所示的DNA片段A同源性大于95%的DNA片段；
[0028] 若含有所述DNA片段A，则所述植物样品为或候选为所述转基因大豆或其后代；
[0029] 若不含有所述DNA片段A，则所述植物样品不为或候选不为所述转基因大豆或其后 代。
[0030] 上述方法中，
[0031] 所述方法为如下1)或2)或3):
[0032] 1)直接测序植物样品或制品的基因组DNA，判断所述测序植物样品含有所述DNA片 段A;
[0033] 2)用引物对域引物对2进行PCR扩增，若有目的扩增产物，则所述植物样品或制品 含有所述DNA片段A;
[0034] 所述引物对巧能够扩增由所述外源DNA片段5'端和紧邻其的所述上游侧翼序列 部分或全部片段组成的DNA分子甲的引物对;其对应的目的扩增产物为所述DNA分子甲；
[0035] 所述引物对2为能够扩增含有所述外源DNA片段3'端和紧邻其的所述下游侧翼序 列的部分或全部组成的DNA分子乙的引物对;其对应的目的扩增产物为所述DNA分子乙；
[0036] 3)用能特异结合所述DNA分子甲或其DNA分子乙的探针对所述待测植物样品DNA进 行Southern杂交，若能杂交得到杂交片段，则所述植物样品来源于所述转基因大豆或其后 代。
[0037] 上述方法中，所述引物对1由序列表中序列4所示的单链DNA分子和序列表中序列 11所示的单链DNA分子组成；
[0038] 所述引物对1对应的目的特异片段大小为1529bp，其核巧酸序列具体为序列14;
[0039] 所述引物对2由序列表中序列12所示的单链DNA分子和序列表中序列13所示的单 链DNA分子组成；
[0040] 所述引物对2对应的目的特异片段大小为2203bp，其核巧酸序列具体为序列15;
[0041 ] 3)中，所述探针的核巧酸序列为序列6。
[0042] 所述转基因大豆的后代为W所述转基因大豆为亲本衍生的转基因材料，包括用所 述转基因大豆诱变或与其他大豆杂交得到的衍生后代或所述诱变或杂交后代再进行衍生 得到的后代。
[0043] 本发明第Ξ个目的是提供用于检测样品是否来源于所述转基因大豆或其后代的 试剂盒。
[0044] 本发明提供的试剂盒，包括1)所述外源DNA片段、2)所述引物对1、3)所述引物对2 或4)所述探针。
[0045] 上述试剂盒还可W记载上述方法的说明书。
[0046] 所述转基因大豆的后代为W所述转基因大豆为亲本衍生的转基因材料，包括用所 述转基因大豆诱变或与其他大豆杂交得到的衍生后代或所述诱变或杂交后代再进行衍生 得到的后代。
[0047] 上述方法制备的转基因大豆在育种和/或生产加工中的应用。
[004引本发明的实验证明，本发明采用在大豆19号染色体的50,543,767至50,543,792位 置间插入外源DNA片段，得到含有外源DNA片段的转基因大豆;外源DNA片段包括草甘麟抗性 基因 G2-aroA和草甘麟降解基因 N-乙酷转移酶基因 GAT基因；转基因大豆对草甘麟抗性高于 未转基因的野生型大豆。该转基因大豆对高剂量草甘麟具有耐受性，其可进一步通过与优 良大豆株系杂交来改良W优化其他农艺性状如产量、品质、抗病虫性等。该转外源DNA片段 大豆共表达草甘麟抗性基因 EPSPS(G2-aroA)和草甘麟降解基因 N-乙酷转移酶基因（GAT)， 在苗期(子叶出±且真叶未展开时期)单株对1-1.化1的草甘麟异丙胺盐(Roundup)原液处 理具有耐受性，田间对每公顷约3至12升的草甘麟异丙胺盐(Roundup)处理具有耐受性。获 得良好杂草控制的总标准计量根据杂草压力在每公顷3-6升之间变动。本发明中的转基因 大豆在运些浓度处理时甚至更