转录因子结合位点核巧酸碱基多态性，设计含兼并碱基的模板 序列，其对转录因子整体活性检测结果将更加准确。
[0078] W制备转录因子SMAD2的EMSA探针并用于检测100个位点为例，对本发明方法和传 统方法的成本进行了比较。采用传统方法合成单链并制备双链探针的成本为100000元（100 位点单链探针：100 X 1000)(参考上海生工生物合成价格），而采用本发明方法制备探针的 成本为7000元（模板50 X 100+标记的引物1000+PCR10 X 100)(参考上海生工生物合成价 格）。若检测位点数越大，本发明探针成本越低。
[0079] 实施例 2、NFKB3
[0080] 根据册C0M0C0或JASPAR数据库的NF邸3序列直接确定转录因子结合序列，获得的 转录因子结合序列为AGTTGGAAATYCCTCCCAGGC。在该转录因子结合序列的5 '及3 '端分别添 加接头序列(GCATCATGATGC，SEQ ID N0:2)，获得模板链(接头序列+转录因子结合序列+接 头序列，GCATCATGATGC+AGTTGGAAATYCCTCCCAGGC+GCATCATGATGC，SEQ ID NO: 5)。该序列送 交基因合成公司合成。同时合成突变单链，其序列为GCATCATGATGC+AGCTAGYCTGACATCACGCTG +GCATCATGATGC(沈Q ID N0:12)。
[0081] 本实施例中的合成引物、PCR扩增合成双链探针和EMSA的方法与实施例1相同。引 物经LNA修饰后的序列为GcATcATgATgC(小写字母为LNA修饰锁核巧酸）。探针电泳图如图5， EMSA结果如图6所示。
[0082] 对比例2
[0083] 本对比例针对NFKB3序列采用传统的化学合成结合退火方式制备EMSA探针。化学 合成的单链探针的序列为 AGTTGGAAATYCCTCCCAGGC(SEQ ID N0:13)、 GCCTGGGAGGRATTTCCAACT(SEQ ID NO: 14)，竞争突变探针序列为AGCTAGYCTGACATCACGCTG (沈9 10顯：15)、〔46〔6了64了61^46亂了46口'(569 10^:16)，末端分别进行生物素标记，然 后95°C水浴5min，自然冷却形成双链EMSA探针，复性率不高于80%。
[0084]用本对比例获得的EMSA探针按照实施例2所述的方法进行EMSA、电泳分析、电转运 及紫外交联和信号检测。结果如图7所示。
[008引对比传统探针制备方法(对比例2)与本发明探针制备法(实施例2化MSA实验结果 可知，传统探针制备方法制得的探针进行EMSA，自由探针存在双带现象，运是由于复性效率 低所引起，对结果的判定上容易引起假阳性误判；本发明探针制备方法制备的探针进行 EMSA，自由探针由于标记引物分子量相对于双链标记探针分子量差距明显且自身较小，一 般会电泳出凝胶或通过探针纯化的方式去除，所W-般不会引发双带现象，而且条带间比 较均衡显影效果比较美观。
[0086] 实施例 3、C-JUN
[0087] 根据册C0M0C0或JASPAR数据库的C-JUN序列直接确定转录因子结合序列，获得的 转录因子结合序列为TCCGTGTTCTGACTCTTGAGGGTCTTC。在该转录因子结合序列的5 '及3 '端 分别添加接头序列(GGGCTAGCCC，SEQ ID N0:3)，获得模板链(接头序列+转录因子结合序列 +接头序列，GGGCTAGCCC+TCCGTGTTCTGACTCTTGAGGGTCTTC+GGGCTAGCCC，SEQ ID N0:6)。该序 列送交基因合成公司合成。同时合成突变单链，所述突变单链的具体序列为GGGCTAGCCC+ TCCTCGTCGTGTCAGTGGTCTTATGTC+GGGCTAGCCC(沈Q ID N0:17)。
[0088] 本实施例中的合成引物、PCR扩增合成双链探针方法和EMSA实施例1相同，但是序 列不同。引物经LNA修饰后的序列为GgGctAgCcC。探针电泳图如图8，EMSA结果如图9所示。
[0089] 对比例3
[0090] 本对比例针对C-JUN序列采用传统的化学合成结合退火方式制备EMSA探针。化学 合成的单链探针的序列为TCCGTGTTCTGACTCTTGAGGGTCTTC(SEQ ID N0:18)、 GAAGACCCTCAAGAGTCAGAACACGGA(SEQ ID N0:19)，竞争突变探针序列为 TCCTCGTCGTGTCAGTGGTCTTATGTC(SEQ ID N0:20)、GACATAAGACCACTGACACGACGAGGA(SEQ ID N0:21)，末端分别进行生物素标记，然后95°C水浴5min，自然冷却形成双链EMSA探针，复性 率不高于80%。
[0091] 用本对比例获得的EMSA探针按照实施例3所述的方法进行EMSA、电泳分析、电转运 及紫外交联和信号检测。结果如图10所示。
[0092] 对比传统探针制备方法(对比例3)与本发明探针制备方法(实施例3化MSA实验结 果可知，使用传统探针制备方法获得的探针进行EMSA，条带不清，拖尾严重;使用本发明探 针制备方法的探针进行EMSA，带型清晰明确，更利于结果判断，结果更加严谨准确。
[0093] 由上述各实施例和对比例可知，本发明EMSA探针明显优于传统EMSA探针。在制备 方法方面，传统EMSA探针采用化学合成修饰的单链探针、低溫退火、纯化检测等获得，具有 探针标记效率低、纯度不高、降解程度大及结合效率不稳定等缺点，进而导致拖尾、模糊、出 现多条结果条带等现象。相较于传统EMSA探针，本发明EMSA探针制备时采用生物素标记了 接头序列，针对多样品多物种均能使用，探针利用率高，成本低。同时，由于探针纯度高，显 影条带特异性强，结果条带清晰、单一，且无拖尾现象，无假阴性出现。
[0094] 分析转录因子结合位点矩阵时，发现存在多个单核巧酸多态性，因此，传统EMSA探 针需要有针对性的设计多条探针。在低溫复性时，需要根据序列逐个复性或者混合复性，但 是，探针逐个复性会使成本大大增加，而混合复性又会造成碱基错配现象，导致探针特异性 低。本发明直接根据矩阵序列合成简并序列模板，添加生物素标记的接头序列，并通过PCR 扩增得到特异性的EMSA探针，成功的避免了传统探针带来的碱基错配现象，特异性远超传 统EMSA探针。
[0095] W上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并 不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员 来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可W做出若干变形和改进，运些都属于本发明的保 护范围。因此，本发明专利的保护范围应W所附权利要求为准。
【主权项】
1. 一种EMSA探针，其特征在于，包含第一条链，所述第一条链包含转录因子结合序列和 位于其5 '及3 '端的接头序列，所述接头序列为回文序列。2. 根据权利要求1所述的EMSA探针，其特征在于，所述接头序列的长度为8-15nt。3. 根据权利要求1所述的EMSA探针，其特征在于，所述接头序列经生物素标记和LNA修 饰。4. 根据权利要求2所述的EMSA探针，其特征在于，所述接头序列为GGGTCTAGACCC、 GCATCATGATGC或GGGCTAGCCC。5. 根据权利要求4所述的EMSA探针，其特征在于，所述第一条链的序列为 GGGTCTAGACCCGTGTCHGKCTRGGGTCTAGACCC、 GCATCATGATGCAGTTGGAAATYCCTCCCAGGCGCATCATGATGC或 GGGCTAGCCCTCCGTGTTCTGACTCTTGAGGGTCTTCGGGCTAGCCC，其中 H=A/C/T，K=G/T，R=A/G。6. 根据权利要求1所述的EMSA探针，其特征在于，所述EMSA探针包含与第一条链探针互 补的第二条链。7. 根据权利要求1所述的EMSA探针，其特征在于，所述转录因子结合序列含有简并序 列。8. -种EMSA探针的制备方法，其特征在于，包含以下步骤： 合成模板链和生物素标记且LNA修饰的引物，所述模板链包含转录因子结合序列和位 于其5'及3'端的接头序列，所述接头序列为回文序列，所述引物的核苷酸序列与接头序列 的核苷酸序列相同；采用该引物以模板链为模板进行PCR扩增合成双链EMSA探针。9. 根据权利要求8所述的EMSA探针的制备方法，其特征在于，所述PCR反应体系为：ΙμΜ 模板链 1μL，10μΜ Biotin-LNA-01igo2yL，dNTP Mix 4yL，DNA Polymerase 0.25yL，10XPCR reaction buffer 5yL，ddH20to 50yL;所述PCR反应条件为：94°C5min;95°C10sec，55°C 20sec，72°C8sec，35 循环；72°C10min。10. -种EMSA方法，使用权利要求6所述的EMSA探针进行EMSA。
【专利摘要】本发明公开了一种EMSA方法及其探针和该探针的制备方法。EMSA探针所述包含第一条链，所述第一条链包含转录因子结合序列和位于其5’及3’端的接头序列。所述EMSA探针的制备方法，包含以下步骤：合成模板链和生物素标记且LNA修饰的引物，所述模板链包含转录因子结合序列和位于其5’及3’端的接头序列，所述接头序列为回文序列，所述引物的核苷酸序列与接头序列的核苷酸序列相同；采用该引物以模板链为模板进行PCR扩增合成双链EMSA探针。使用所述的EMSA探针可进行EMSA。本发明由单链探针经PCR制得双链探针，不会出现由于复性不彻底造成的假阴性，还克服了单链自由探针带来的显影误差。
【IPC分类】G01N33/53, C12N15/11, C12Q1/68, C12N15/10, G01N33/561
【公开号】CN105506150
【申请号】CN201610059545
【发明人】董先辉, 王晓香, 曾健, 张娟, 杨嘉杰, 周剑
【申请人】广州伯信生物科技有限公司
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2016年1月27日