OsJMJ714影响水稻籽粒大小以及盐胁迫耐性的功能及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，涉及一种调控水稻籽粒大小以及盐协迫耐性的基因及其在农作物转基因改良中的应用。
【背景技术】
[0002]种子大小是决定水稻产量的重要因素之一，长期以来一直是很多作物育种改良的重要目标，其调控机制备受关注。生长素作为最重要的植物激素之一，参与了植物生长发育的众多重要过程。尽管生长素的合成、运输和信号转导在模式植物拟南芥中研究已比较深入，然而其在作物中的研究和对作物产量的影响仍知之甚少。丝裂原活化蛋白激酶MAPKs是生物体中广泛存在的蛋白激酶，它们在植物生长发育以及胁迫反应过程中发挥了重要作用。中国科学院遗传与发育生物学研究所和中国水稻所合作鉴定了一个水稻矮杆小粒突变体dsgl，DSGl编码一个丝裂原活化蛋白激酶0sMAPK6细胞生物学分析表明DSGl是通过调控细胞分裂而调节了细胞数目，进而影响了水稻种子大小及其生物量。中国科学院遗传与发育生物学研究所储成才研究员和中科院院士李家洋课题组合作通过对一水稻大粒显性突变体(Big grainl, Bgl-D)的研究，发现BGl编码一个受生长素特异诱导的早期响应的未知功能蛋白，在水稻茎和穗的维管组织中特异表达。BGl过表达株系生长素极性运输能力显著增强，并导致水稻籽粒显著增大。田间试验表明，BGl过量表达株系与对照相比千粒重增加25%，产量增加过量表达植株生物量也显著提高。华中农业大学克隆的GS5是一个种子大小的正调控因子，可以促进水稻颖壳细胞的横向分裂，进而增大颖壳的宽度，最终增大种子的大小以及增加谷粒的重量和单株产量。研究表明，通过GS5的调控，水稻谷粒可增宽8.7%，粒重可增加7%，单株产量可提高7.4%。这为作物高产育种提供了具有自主知识产权的新技术。华中农业大学张启发院士鉴定控制水稻粒形基因GS3，证实了 GS3是调控谷粒大小的主要基因，揭示了基因所编码蛋白的结构与功能之间的关系。研究还发现，几乎所有的优良梗稻品种都带有完整的GS3蛋白，表现为中等粒型，而优良长粒型軸稻品种的GS3蛋白无功能，通过对该基因的导入和替换，能有效地改变水稻品种的粒型，表明GS3对水稻的产量和品质有重要的决定作用，是粒型的变异和演化的主要决定因子之一。这些研究为解析种子大小的遗传调控机制以及改良水稻品质与产量奠定了良好的基础。
[0003]盐对植物造成伤害有两种类型，一种是游离于根表面的离子导致的渗透胁迫，另一种是钠离子或者氯离子进入植物体内产生离子毒害。许多耐盐植物耐盐的原因是这些植物可以有效控制盐离子的摄入并将它们储存在细胞组分和组织中以应对外界高盐对其造成的伤害。植物在受到盐胁迫时，往往改变自身形态以适应胁迫。植物可以通过调整根的生长和根的结构来响应盐胁迫。单子叶植物的初生根在幼苗的早期发育和后续的侧根形成阶段有重要作用。单子叶植物水稻的侧根起始于韧皮部中柱鞘细胞。盐胁迫信号通过调控初生根的生长和侧根的发育来调整根系结构。盐胁迫是通过减少细胞分裂和伸长来抑制初生根的生长，对侧根的影响相对复杂，中浓度的盐离子可以促进侧根的起始，高浓度盐离子引起渗透胁迫并阻断侧根的起始。
[0004]植物生长发育由遗传调控和表观遗传调控协同决定，表观遗传修饰影响染色质构型的开发或关闭进而导致基因的活化或沉默。含JumonjiC ( JmjC)结构域的蛋白具有组蛋白去甲基化酶功能，拟南芥和水稻JMJC蛋白影响组蛋白去甲基化和DNA甲基化修饰并对花期和花器官发育进行精细调控。本发明对水稻中编码JmjC结构域的组蛋白去甲基化酶0sJMJ714基因超表达，导致水稻体内的组蛋白H3K9脱甲基化和DNA甲基化的修饰发生变化，并影响水稻籽粒大小与盐胁迫耐性。
【发明内容】
[0005]本发明人创建水稻Os JMJ714基因过表达的转基因水稻，证实Os JMJA714调控水稻籽粒大小及其对盐碱逆境的应答反应。在正常生长状态下，0sJMJ714转基因水稻籽粒变小，而该基因沉默的转基因水稻种子比野生型的大;抗逆性表型分析发现该基因过表达降低水稻对盐胁迫的耐性，而该基因沉默则提高转基因水稻的耐性，表明0sJMJ714基因在水稻农艺性状与胁迫耐性方面具有应用价值。
[0006]本发明提供的技术方案是:一种水稻JMJ714基因，其核苷酸序列如SEQID NO:1所示，以及简并序列，称为0sJMJ714基因。该基因过表达影响水稻籽粒大小和盐胁迫耐性形成等过程。
[0007]所述基因编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0008]本发明还提供包含所述的基因的表达载体，优选为植物表达载体。
[0009 ]本发明还提供包含所述的基因的宿主细胞。
[0010]本发明还提供所述的基因在培育抗逆作物品种的应用，是将包括所述基因的表达载体导入植物中，筛选获得抗逆性降低的植株，优先为水稻，所述抗逆性质为盐胁迫敏感。这样可以制作盐胁迫敏感的水稻品种材料。
[0011]本发明还提供所述的基因在培育改变了籽粒大小的应用，是将所述基因导入植物中，筛选获得改变了水稻籽粒大小，所述植物为农作物，优选为水稻。
[0012]通过本发明可以通过基因沉默技术，使水稻中的0sJMJ714基因表达降低或不表达，因而可以获得抗逆性(盐胁迫)增强的水稻品种，或者籽粒变大的水稻品种。
[0013]本发明研究表明0sJMJ714调控水稻籽粒大小及其在水稻应答盐碱逆境胁迫反应中发挥重要的作用。通过转基因技术创建0sJMJ714基因超表达和基因沉默的的转基因水稻，超表达的转基因水稻籽粒变小和盐胁迫耐性降低，而该基因沉默的转基因水稻的籽粒变大，盐胁迫耐性提高，进而可以利用该基因进行水稻等农作物的重要农艺性状和胁迫耐性的遗传改良。
[0014]
【附图说明】
[0015]图1转OsJMJ714基因水稻的的分子鉴定，A:DNA水平检鉴定转基因水稻;B: RNA水平鉴定转基因水稻;C: Os JMJ714基因沉默转基因水稻的表达水平分析。
[0016]图2 0sJMJ714调控水稻株籽粒大小。
[0017]图3OsJMJ714调控水稻耐盐性。
[0018]
【具体实施方式】
[0019]下面通过【具体实施方式】的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。
[0020]实施例一:转基因水稻材料的创建与鉴定
1、0sJMJ714S因重组植物表达载体的构建
利用0sJMJ714(基因号:0s09g0483600)编码区序列为模板，通过生物信息学分析设计0sJMJ714-F 5'-AGTGGATCCATGGAGCGCGCAGTGCGGGA-3',0sJMJ714-R 5'-GGCGGTACCTCAATCATTCGTCTCCTCGA-3’。从cDNA文库中 PCR扩增0sJMJ714全长为 1080bp的编码区序列片段，利用BamHI和KpnI对PCR片段和植物表达载体pCAMBIA1205进行双酶切，然后进行连接并转入大肠杆菌DH5a中，挑取阳性克隆进行鉴定和测序分析，获得插入0sJMJ714基因并且读码框正确的重组植物表达载体PCAMBIA1205-JMJ714，导入农杆菌AGLO中。
[0021 ]利用人工miRNA技术敲除水稻中的OsEAR因子的水稻材料创建
根据靶基因的作用位点通过生物信息学分析设计约21碱基的amiRNA引物，以内源miRNA前体(pre-miRNA)骨架为模板，采用重叠PCR构建amiRNA基因；将amiRNA基因