东方巴贝斯虫凝血酶素基因1及其编码的蛋白的制作方法
【技术领域】
[0001 ]本发明属于分子生物学领域，涉及一个新基因及其重组蛋白，具体是指东方巴贝 斯虫凝血酶素基因1及其编码的重组蛋白，本发明还涉及重组蛋白的应用。
【背景技术】
[0002] 水牛巴贝斯虫病(Babesiosis)是由东方巴贝斯虫(Babesia orientalis)寄生于 水牛的红细胞引起的以高热、贫血、黄疸和血红蛋白尿为临床特征的蜱传性血液原虫病。该 病在我过南方的湖北、福建、江西、安徽、江苏、浙江、湖南、广西、云南、贵州等省份广泛流 行，对水牛养殖业和农业生产造成严重影响。东方巴贝斯虫自1984年首次报道以来，其传播 和流行呈扩散趋势，分析其原因主要有以下三点：首先，动物一旦感染巴贝斯虫，便终生带 虫，虫体在动物体内长期存在，一旦动物抵抗力低下或应激情况下即表现严重的临床症状； 其次，东方巴贝斯虫的传播媒介镰形扇头蜱是三宿主蜱，一年发生一代，该蜱可经卵传播东 方巴贝斯虫，据文献报道，阳性蜱可传播东方巴贝斯虫30代以上；第三，由于近年来交通运 输越来越发达，在一定程度上增加了东方巴贝斯虫病的传播和流行;第四，随着近年来肉牛 养殖业的发展，大量非流行区的牛进入东方巴贝斯虫流行区育肥，而这些牛几乎100%发 病。
[0003] 综合以上可看出，一旦某区域成为疫区，东方巴贝斯虫病便难以根治和清除，因此 要控制该病的传播和流行，诊断和疫苗尤为重要。到目前为止，东方巴贝斯虫病的检测没有 诊断试剂盒。因而筛选、鉴定具有良好免疫原性和反应原性的东方巴贝斯虫抗原便是解决 途径之一。
【发明内容】
[0004] 本发明的第一个目的是从东方巴贝斯虫中获得凝血酶素基因1。
[0005] 本发明的第二个目的是将所述东方巴贝斯虫凝血酶素基因1在大肠杆菌表达系统 中高效表达获得重组蛋白。
[0006] 本发明的第三个目的是提供上述重组蛋白在制备东方巴贝斯虫病的检测试剂盒 中的应用。
[0007] (1)本发明所述东方巴贝斯虫凝血酶素基因1的获得:利用聚合酶链式反应(PCR) 的方法，以东方巴贝斯虫总RNA为模板，反转录成cDNA，经PCR得到东方巴贝斯虫凝血酶素基 因1，其核苷酸序列的开放阅读框(0RF)如序列表SEQ ID N0:1所示。
[0008] (2)编码了所述东方巴贝斯虫凝血酶素基因1的重组蛋白，其氨基酸序列如序列表 SEQIDN0:2**。
[0009] (3)所述重组蛋白，其制备方法为：将序列表SEQ ID NO: 1所示的东方巴贝斯虫凝 血酶素基因1开放阅读框(0RF)与大肠杆菌表达载体构建重组表达质粒pE-SUMO-TRAPl，电 转化至BL21中，抗生素氨苄青霉素筛选高抗性的转化子，并用0.8mmol/L IPTG于37°C诱导 4h。收集上述IPTG诱导表达的菌液，对其进行分离纯化的蛋白即为编码了东方巴贝斯虫凝 血酶素基因1的重组蛋白。
[0010] (4)重组蛋白纯化处理，按上述方法诱导表达1000ml菌液，将表达的菌液转移到离 心管于4°C条件下8000r/min离心10min集菌。取30mLHis_binding buffer(PH7.8)重悬菌体 沉淀后，使用压力破碎仪破碎(3次）；4°C，10000r/min离心5min，弃沉淀，收集上清，微滤后， 用镍亲和层析柱(GE)纯化，纯化步骤同说明书。
[0011] (5)Western blot方法检测重组表达蛋白的反应原性--将纯化的重组蛋白进行 SDS-PAGE电泳后转移到NC膜上，分别以东方巴贝斯虫水牛阳性血清和健康水牛血清做一 抗、HRP标记的兔抗牛IgG为二抗进行Western blot分析。
[0012] (6)本发明获得的重组蛋白具有生物活性，具有良好的反应原性。采用该重组蛋白 进行Western blot，分别与感染东方巴贝斯虫的水牛阳性血清和未感染的阴性血清反应， 结果表面仅阳性血清有特异性的反应带，阴性血清无反应，可有效检测东方巴贝斯虫病的 抗原。因此，该重组蛋白可应用于制备东方巴贝斯虫病检测试剂盒等相关应用。
[0013] 本发明的有益效果：
[0014] 本发明涉及的编码了东方巴贝斯虫凝血酶素基因1的重组蛋白可有效检测感染水 牛血液中的东方巴贝斯虫病抗原的存在，具有良好的反应原性，是开发检测东方巴贝斯虫 病血清学诊断方法的候选因子，有助于控制水牛的巴贝斯虫病在我国的流行和传播。
【附图说明】
[0015]图1为东方巴贝斯虫凝血酶素基因1扩增电泳图。1:表达引物从PMD-19T-TRAP1质 粒中扩增目的基因；2:克隆引物从东方巴贝斯虫总cDNA中扩增目的基因;M:DNA分子量标准 (购自大连宝生物）。
[0016]图2为本发明重组质粒酶切产物电泳图。1:表达引物扩增产物酶切后的TRAP1目的 片段;2，3: pE-SUMO-TRAPl单酶切后产物;M: DNA分子量标准。
[0017] 图3为东方巴贝斯虫凝血酶素基因1的重组表达产物定性分析的SDS-PAGE电泳结 果。1: IPTG诱导的pE-SUMO-TRAPl表达产物;2:未诱导的pE-SUMO-TRAPl ;Μ:蛋白质分子质量 标准。
[0018] 图4为东方巴贝斯虫凝血酶素基因1的重组表达产物提取的SDS-PAGE电泳结果。1: 表达菌裂解液的上清;2:表达菌裂解液的包涵体;M:蛋白质分子质量标准。
[0019] 图5为东方巴贝斯虫凝血酶素基因1纯化后的重组表达产物的SDS-PAGE电泳结果。 1:纯化后的重组表达产物;Μ:蛋白质分子质量标准。
[0020] 图6为东方巴贝斯虫凝血酶素基因1重组蛋白的Western blot鉴定。1:重组蛋白与 东方巴贝斯虫阳性血清反应;2:重组蛋白与健康水牛血清反应;M:蛋白质分子质量标准。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合实施例对本发明进行详细说明。
[0022] 实施例1:东方巴贝斯虫的纯化
[0023] 将新鲜染虫红细胞(染虫率约5~10%)装入一灭菌的无 RNase的离心管中，低速离 心(3000rpm)5min，收集血细胞并去除上清与血细胞之间的白色絮状物（白细胞）；加入血细 胞3倍体积的lxTOS，摇匀，3000rpm离心5min，收集血细胞，重复此操作1次直至上清无色透 明；加入2倍体积的红细胞裂解液，摇匀，室温静置lOmin，lOOOOrpm离心7min，收集沉淀；加 入3倍体积的lxPBS，摇匀，lOOOOrpm离心7min，收集沉淀，重复此步骤直至上清无色透明；沉 淀用灭菌的无 RNase的roS洗一次，加入1/10体积的灭菌无 RNase的PBS溶，此即为纯化的无 白细胞的东方巴贝斯虫体。
[0024]实施例2:东方巴贝斯虫总RNA的提取
[0025] 所有提取RNA用的器皿均用0.1 %DEPC水处理，150°C烘烤4h ;塑料器皿经0.1 % DEPC水浸泡过夜，121°C高温高压灭菌20min;金属用具经lmol/L的NaOH浸泡2h，经0.01 %的 DEPC水彻底冲洗后，37°C烘干；各试剂用无核糖核酸酶(Ribonuclease，RNase)的0.01 % DEPC水配置。取150yL上述方法纯化的东方巴贝斯虫提取RNA。总RNA抽提按Tr i zo 1试剂的说 明书进行。提取的总RNA样品冻存于-80°C，备用。
[0026]实施例3:东方巴贝斯虫总cDNA的合成
[0027] 使用TaKaRa公司的 PrimeScript?Reverse Transcriptase反转录试剂盒，以提取 的东方巴贝斯虫总RNA为模板进行反转录，具体操作步骤为：
[0028] ①在Microtube中配制下列混合液
[0030]②在PCR仪上进行下列条件的变性、退火反应：
[0031 ] 65°C 5minU水上急冷
[0032] ③在上述Microtube管中配制下列反转录反应液。
[0034] ④在PCR仪上按下列条件进行反转录反应：
[0035] 30°C lOmin
[0036] 丄
[0037] 42〇C 30-60min
[0038] 丄
[0039] 95°C 5min (酶失活)处理后，冰上放置。
[0040]反转录所得的cDNA放-20保存备用。
[0041]实施例4:东方巴贝斯虫凝血酶素基因 1的克隆及序列分析
[0042] 1)引物设计
[0043] 根据NCBI/GenBank上已登录顶器门寄生虫的凝血酶素基因 1的序列信息，根据序 列的保守性，用Primer 5.0软件在cDNA序列开放阅读框(0RF)的上下游区域，设对引物 (TRA卟FI，TRAP1-R1);TRAP1-F1:5 '-ATGATACCGTTTTACGCAATCTG-3 '；TRA卟R1:5 '-TCAACTACTACGTGCAATATTTAT-3'。
[0044] 2)PCR扩增：以东方巴贝斯虫cDNA为模板进行PCR扩增，反应体系为25yL，PCR反应 体系如下：
[0046] PCR反应条件：反应条件为95°C5min ; 94°C30sec，57°C90sec，72°C45sec ; 72°C lOmin; 35个循环周期。
[0047] 3)PCR产物鉴