一种利用微生物发酵生产10-脱乙酰巴卡亭iii的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物制药及医药工程领域，具体涉及到一种利用Tolumonasosonensi s生产10-脱乙醜巴卡亭111的方法，该方法以To lumonas osonensis CGMCCN0.7562为菌种，以巴卡亭III为底物，采用微生物ClO-脱乙酰基反应转化生产10-脱乙酰巴卡亭III的方法。
【背景技术】
[0002]10-脱乙酰巴卡亭III (10-DAB)是紫杉烷类抗肿瘤药物的典型代表一多烯紫杉醇的前体物质。它广泛分布于红豆杉植物的树叶、根、皮、枝干中，在不同种植物的含量差异较大，但总体含量偏低，一般在0.00513%-0.175%左右。其传统制备方法是从植物中进行提取，但此过程工艺步骤冗长、需要经过多次层析、梯度洗脱、多次重结晶后才能获得精制品，不仅造成了 10-DAB的大量损失，降低了收率，而且过程中还大量使用乙腈和石油醚等有机溶剂，对环境造成不良影响。
[0003]微生物转化是指某一微生物将一种物质(底物)转化成为另一种物质(产物)的过程，其本质是利用生物体所产生的酶对外源化合物进行酶催化反应，它具有反应选择性强(位置选择性、立体选择性)、反应条件温和、副产物少和不造成环境污染等优点。Tolumonasosonensis是2011年Matthew等人发现的属于甲苯单胞菌属的一个新种，目前利用该菌株转化巴卡亭III生产10-脱乙酰巴卡亭III的研究还未见报道。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种工艺简单、副产物少、经济实用、反应条件温和且对环境友好的生产10-DAB的方法。
[0005]本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:
[0006]—种利用微生物发酵生产10-脱乙酰巴卡亭111的方法，采用To lumonasosonensis为发酵菌种，经一级种子培养、二级发酵培养，在得到的菌体发酵液中投入底物巴卡亭III，进行ClO-脱乙酰基反应转化，生成10-DAB，所述的Tolumonas osonensis由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCC N0.7562。
[0007]而且，所述的在制成的菌体发酵液投入巴卡亭III进行ClO-脱乙酰基反应的方式是:用有机溶剂将巴卡亭III助溶，配制成的溶液加入到菌体发酵液中，巴卡亭III投入的终浓度为0.04-lg/L，有机溶剂加入的体积比例为2-25%。
[0008]而且，所述的有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯的其中一种。
[0009]而且，所述的ClO-脱乙酰基反应的转化条件是:28-37°C、150-300r/min转化培养60-144ho
[0010]而且，所述的Tolumonas osonensis的一级种子培养的方式是:将Tolumonasosonensis CGMCC N0.7562在斜面上培养，22°C_30°C下恒温培养2_5d后，取一满环至种子培养基中，22°C-30°C、120-280r/min振荡培养18-30h，得到适于接种的种子培养液。
[0011]而且，所述的Tolumonas osonensis的二级发酵培养的方式是:将种子培养液以5%-15%的接种量接入发酵培养基，22°030°(3、120-28(^/1^11振荡培养20-3211进行二级发酵培养，得到菌体发酵液。
[0012]一种利用微生物发酵生产10-脱乙酰巴卡亭111的方法，采用To lumonasosonensis为发酵菌种，经一级种子培养、二级发酵培养，得到的菌体，将菌体破碎，在破碎菌体菌悬液中投入底物巴卡亭II I，进行ClO-脱乙酰基反应转化，生成1-DAB，所述的Tolumonas osonensis由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCCN0.7562。
[0013]而且，所述破碎方法为化学破碎法、物理破碎法或干燥破碎。
[0014]而且，所述破碎方法为甲苯破碎、丙酮破碎、异丙醇破碎、超声破碎、反复冻融破碎、冷热交替破碎或干燥破碎。
[0015]本发明的有益效果是:
[0016]本发明提供的10-DAB的制备方法，以To lumonas osonensis为菌种，巴卡亭III作为底物采用微生物一步C1-脱乙酰基反应制备10-DAB。本方法具有操作简单、反应专一性好、成本低、反应条件温和、产物易于分离纯化等优点，克服了现有方法步骤繁琐、收率低、副产物多、分离纯化困难、环境不友好等缺点。
[0017]本发明涉及的微生物转化方法代替了传统的从杉科植物中直接提取制备10-DAB的方法，具有操作简单、反应专一性好、成本低、反应条件温和、产物易于分离纯化等优点。对用微生物转化方法制备天然药物具有非常重要的意义。
【附图说明】
[0018]图1为本发明中巴卡亭III转化生成1-DAB的反应方程式；
[0019]图2为本发明菌株Tolumonasosonensis CGMCC N0.7562转化巴卡亭III生成 10-DAB的TLC结果。1:菌体对照，2:转化液样品，3:巴卡亭III标准品(0.3mg/mL) ,4: 10-DAB标准品(0.lmg/mL)；
[0020]图3为本发明菌株Tolumonasosonensis CGMCC N0.7562转化巴卡亭III生成 10-DAB的HPLC结果。图3-1:巴卡亭III(0.3mg/mL)和 10_DAB(0.lmg/mL)的混合标准品；图3_2:转化液样品；
[0021 ] 图4为本发明菌株Tolumonas osonensis CGMCC Νο.7562转化巴卡亭III反应的转化产物的LC-MS图，图4-1:TOF MS负离子扫描模式，图4-2:TOF MS正离子扫描模式。
【具体实施方式】
[0022]下面结合附图并通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
[0023]本发明所涉及的菌株TolumonasOsonensis P2-A-1 (以下简称T.0sonensis P2-A-1 )，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCN0.7562，所涉及公开文献包括CN103509735A。
[0024]以下实施例中所用到的培养基与缓冲液为:
[0025]所用培养基:
[0026]①胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)(L—O:胰蛋白胨17.0g、大豆蛋白胨3.0g、NaCl
5.0g、K2HP04 2.5g、葡萄糖2.5g、pH=7.3，115°C灭菌20min。
[0027]②LB(Luria-Bertani)液体培养基(L—1):胰蛋白胨1g，酵母提取物5g，NaCl 1g，调节 pH=7.2。121°C 灭菌 20min。
[0028]所用缓冲液:
[0029]50mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.2):配制50mmol/L磷酸氢二钾溶液300mL，用50mmol/L磷酸二氢钾溶液将pH调至7.2。
[0030]具体论述如下:
[0031]一、菌株?\Osonensis P2-A-1转化巴卡亭III实验主要步骤如下:
[0032]⑴一级种子培养
[0033]将T.0sonensis P2-A-1作为生产菌株从TSB斜面培养基上接一满环到50mL LB液体培养基的250mL三角瓶中，22°C200r/min振荡培养ld，得到适于接种的种子培养液。
[0034]⑵二级发酵培养
[0035]将种子培养液以5%的接种量接种到装有50mLLB液体培养基的250mL三角瓶中，22°C200r/min 振荡培养 Id
[0036]⑶转化实验
[0037]向二级发酵培养液中加入I.5mg/mL的巴卡亭III甲醇溶液2mL，37°C200r/min继续振荡培养3d。实验中，以不投加底物溶液的培养液作为空白对照。
[0038]转化结束后加入50mL氯仿，37°C200r/min振荡萃取lh，然后经5000r/min离心5min，得到氯仿萃取液。用等体积的氯仿萃取三次，合并萃取液，旋蒸以挥干有机溶剂。蒸干后的样品用ImL甲醇复溶，用0.22μπι滤膜进行过滤，滤液即为待测样品溶液，用高液相色谱法计算转化率和产物生成率。
[0039]转化产物分析
[0040]①薄层层析分析(TLC)
[0041]展开剂采用丙酮:石油醚= 2:3(ν/ν)，显色剂采用硫酸:乙醇=1:9(v/v)，105°C下烘烤显色l-3min，观察斑点的颜色并计算比移值。
[0042]②高效液相色谱分析(HPLC)
[0043]色谱条件为:PhenomenexC18(5ym,250mmX4.6mm)；流动相:甲醇:乙臆:水(10:33:57，v/v/v)；检测波长:227nm ；流速:0.8mL/min ；柱温:30°C ；进样量:10yL。
[0044]③高效液相色谱质谱联用分析(LC-MS)
[0045]利用制备型硅胶板对转化产物进行分离，展开剂为丙酮:石油醚=2:3(v/v)，显色剂为硫酸:乙醇=1:9(v/v)，105°C下烘烤显色l_3min后，在254nm紫外灯下观察层析板，用铅笔在转化产物斑点所在位置处划出范围，用刀片小心刮下并收集此范围内的硅胶于2.0mL Eppendorf管中，用ImL甲醇将产物从娃胶中反复洗脱下来，进行LC-MS分析。
[0046]色谱条件为:WatersC18色谱柱(100mm X 2.lmm)；流动相:5-95% 乙腈(0.I %FA-乙腈)，0-10min;流速:0.4mL/min;柱温:40°C，进样量10yL。质谱条件:电离源:电喷雾电离(ESI)；检测模式:多反应监测；毛细管电压:3kV;脱溶剂气温度:400°C ；脱溶剂气流量:800L/h ；锥孔气流量:30L/h ；离子源温度:350°C ；碰撞气流速0.12mL/min。
[0047]⑷按此方法进行实验，结果发现在TLC板上菌株T.0sonensiSΡ2-Α-1的转化液样品中