一种快速测定透明质酸酶活性的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种透明质酸酶活性的方法，尤其一种快速测定透明质酸酶活性的方 法。
【背景技术】
[0002] 透明质酸酶有三类同工酶，第一类为经典的透明质酸酶（透明质酸酶EC 3.2.1.35)，多存在哺乳动物的睾丸中，蛇毒中的透明质酸酶也属于此类;第二类为透明质 酸酶EC 3.2.1.36，多存在水蛭的唾液腺中；第三类为透明质酸酶EC 4.2.2.1，多来源于细 菌、真菌、噬菌体等微生物。不同种属来源的透明质酸酶的最适pH值、等电点以及分子量都 不相同，透明质酸酶的活性分为酸性活性(acid active)和中性活性(neutral active)，前 者最适pH值在3与4之间，后者最适pH值在5与6之间。
[0003] 透明质酸又名玻尿酸，主要功能有保水，保湿，抗衰老，促进伤口愈合，减少伤口炎 症。其基本结构是一条无支链的多聚糖。十六烷基三甲基溴化铵(Cetyltrimethylammonium bromide，CTAB)，是一种阳离子表面活性剂，被广泛应用于DNA的提取、粘多糖的测量、改变 固体表表面的湿润性、电池稳定剂等。1955年，Ferrante N发现透明质酸与CTAB在一定条件 发生反应产生浊度，在紫外分光光度计400nm下呈线性相关;陈永浩等人首次将CTAB测定透 明质酸含量的方法称之为CTAB浊度法（"发酵液中透明质酸含量快速检测方法研究[J]"，食 品与发酵工业.2009,35(1))。
[0004] Dorfman A等用牛睾丸酶解透明质酸，用酸性蛋白与小分子透明质酸反应产生池 度，在600nm测吸光度，酸性蛋白需要在4°C操作，其实验条件要求高，重复性差。Stern Μ等 用ELISA使透明质酸覆盖在板孔中，时间为10h，然后用透明质酸酶进行酶解，洗去降解的透 明质酸，用牛血清白蛋白进行反应，在492nm下测吸光度，此方法反应时间长，条件要求高， 且不足以反应透明质酸酶活性。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种快速测定透明质酸酶活性的方法，该方法操作简单， 稳定性好，灵敏度和可重复性高，为透明质酸酶的规模化提取、制备及其应用奠定基础。
[0006] 本发明的目的通过以下技术方案来实现:一种快速测定透明质酸酶活性的方法， 包括以下步骤：
[0007] (1)配制透明质酸溶液:采用醋酸钠缓冲液配制透明质酸溶液，溶液pH为：3〈pH< 7；
[0008] (2)配制十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液；
[0009] (3)制备样品溶液:取步骤（1)的透明质酸溶液，加入透明质酸酶溶液在37°C反应 0.5~1小时，加入十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液后37°C下继续反应8~15分钟，获得样 品溶液；
[0010] (4)制备对照溶液:取步骤（1)的透明质酸溶液，加入十六烷基三甲基溴化铵溶液， 37°C下反应8~15分钟，获得对照溶液；
[0011] (5)测定光密度值:采用酶标仪在波长400nm下测定对样品溶液和对照溶液的光密 度值(0D值）；
[0012] (6)计算结果:根据所获得的样品溶液和对照溶液的光密度值采用下式计算获得 透明质酸酶的活力及比活力，
[0013]
>知?为对照溶液的光密度值，Α?为样品溶液的光密度值，
[0014]
，浓度为样品溶液的浓度，加样量为样 品溶液的加样量。
[0015] CTAB中氮原子与透明质酸中羧基的氧原子形成配对，从而形成不溶于水的复合 物，且经实验证明，CTAB与透明质酸结合所产生的浊度与溶液中透明质酸的量成正相关。利 用透明质酸酶对透明质酸的专一性，让透明质酸酶部分分解透明质酸，将大分子透明质酸 分解为小分子化合物，与CTAB反应形成的复合物减少，降低了样品溶液的浊度，因而可根据 样品溶液和对照溶液的0D值差值计算获得透明质酸酶的活性。由于透明质酸分子量小于 15000Da不能产生足够的电荷与CTAB产生连续的吸附，以至不产生浊度，不遵循朗伯-比尔 定律，导致无法获得准确的测定结果。因此，在测定过程中应避免过度酶解，酶解反应时间 不宜过长，一般控制在0.5~1小时，以保留部分透明质酸不被分解，保证检测结果的准确 性。CTAB既能和未被酶解成小分子的透明质酸合成，使溶液产生浊度，又能终止透明质酸酶 的酶解反应，优化了终止酶解步骤，因而简化了本发明的操作步骤。
[0016] 在本发明人实验过程中发现离子强度和pH值均对CTAB与透明质酸结合产生的浊 度有较大影响。其中离子强度越高，对CTAB与透明质酸结合产生的浊度影响越大，在离子强 度高于0.5M后，不产生浊度;而pH值的影响较为温和，当pH值2 5的时候对CTAB浊度法基本 无影响，pH值=3时CTAB与透明质酸结合不产生浊度。CTAB与透明质酸结合不产生浊度，会 导致无法准确检测透明质酸酶的活性。故，所述步骤(1)的醋酸钠缓冲液的离子强度在0.5M 以下且3〈pH <7。具体地，以0.2M醋酸钠缓冲液为基础添加氯化钠以调整离子强度，调整离 子强度在〇~〇. 5M范围内。本发明中所述离子强度均为氯化钠的离子强度。
[0017] 所述步骤(1)的透明质酸溶液浓度为0.5~1.5ygAil。
[0018] 所述步骤(2)的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液为，2 · 5gCTAB溶解于100ml 2 % (w/v)的NaOH中，浓度为2.5%(w/v)，在本发明人的实验过程中发现20°C时候会出现大量成 团结晶，因此该溶液要在25°C以上储存，防止温度太低导致CTAB结晶。
[0019] 所述步骤(3)中透明质酸酶溶液由透明质酸酶溶解于醋酸钠缓冲液构成，在测透 明质酸酶活性的过程中，蛋白量很重要，量太少，0D值减少不明显，容易出现假阴性，但是也 要防止过度酶解，特别是经过提纯的透明质酸酶，其量应该要比粗蛋白减少到它的提纯倍 数。所以若含透明质酸酶的粗蛋白进行配制，则配成的蛋白浓度为3~5ygAU，加样量为20 ~40μ1;若纯透明质酸酶进行配制，则配成的蛋白浓度为0.1~0.3yg/yl，加样量为3~8μ1。 本发明所述的透明质酸酶可以从各种来源获得，作为本发明的一个实施例，所述透明质酸 酶来源于蛇毒。
[0020] 所述步骤(3)和(4)的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液的添加量为200μ 1。
[0021 ]本发明与现有技术相比具有以下优点：
[0022] (1)本发明运用CTAB与透明质酸结合的原理来测透明质酸酶活性，以透明质酸为 指示剂，通过CTAB法测定透明质酸酶活性。
[0023] CTAB中氮原子与透明质酸中羧基的氧原子形成配对，从而形成不溶于水的复合 物，且CTAB与透明质酸结合所产生的浊度与溶液中透明质酸的量成正相关。透明质酸酶水 解部分透明质酸，将部分大分子透明质酸分解为小分子化合物，那么与CTAB形成不溶于水 的复合物减少，溶液的浊度就会降低，从而与对照溶液的检测结果进行计算，获得透明质酸 酶的活性。
[0024] (2)本发明耗时短：
[0025] 透明质酸分子量小于15000Da不能产生足够的电荷与CTAB产生连续的吸附，以至 不产生浊度，不遵循朗伯-比尔定律，因此，在测定过程中应避免过度酶解，因而酶解反应时 间不宜过长，一般控制在0.5~1小时，以保留部分透明质酸不被分解，保证检测结果的准确 性。
[0026] (3)CTAB既能和未被酶解成小分子的透明质酸合成，使溶液产生浊度，又能终止透 明质酸酶的酶解反应，优化了终止酶解步骤，因而简化了操作步骤。
[0027] (4)透明质酸酶是透明质酸的专一性水解酶，不会受其他杂蛋白的影响，故透明质 酸酶无需经过提纯，也能获得准确的检测结果，测定稳定性好，灵敏度高，可重复性高。
[0028] (5)本发明用酶标仪代替紫外分光光度计来检测，可同时测定多个样品，一次性可 进行96孔检测，非常便捷，还能减少比色皿的误差，可取得更好的测定效果。
[0029] (6)本发明操作简单、快速、稳定性好且灵敏度高，在透明质酸及透明质酸酶的制 备、检测等方面具有较高的应用价值。
[0030] (7)本发明尤其适用于对蛇毒来源的透明质酸酶活性的检测
【具体实施方式】
[0031 ]图1是CTAB与透明质酸反应产生浊度的标准曲线(酶标仪检测0D值）；
[0032]图2是不同离子强度对CTAB法测透明质酸0D值的影响；
[0033]图3-A是离子强度为0M的CTAB法测透明质酸含量的标准曲线；
[0034]图3-B是离子强度为0.1M的CTAB法测透明质酸含量的标准曲线；
[0035]图3-C是离子强度为0.2M的CTAB法测透明质酸含量的标准曲线；
[0036]图3-D是离子强度为0.3M的CTAB法测透明质酸含量的标准曲线；
[0037]图3-E是离子强度为0.4M的CTAB法测透明质酸含量的标准曲线；
[0038]图3-F是离子强度为0.5M的CTAB法测透明质酸含量的标准曲线；
[0039]图4是不同pH值对CTAB法测透明质酸0D值的影响。
【具体实施方式】
[0040]
[0041] 以下实施例仅用于阐述本发明，但是本发明的保护范围并非仅仅局限于此，本技 术领域的普通技术人员通过以上本发明公开内容均可实现本发明的目的。
[0042] 实施例1:酶标仪代替紫外分光光度计做透明质酸含量的标准曲线
[0043]食品与发酵工业.2009，35( 1)中的"发酵液中透明质酸含量快速检测方法研究 [J]"公开的CTAB法测透明质酸含量检测仪器多为紫外分光光度计，然而紫外分光光度计不 能同时测量多个样品，且需要样品量较大。酶标仪能同时测量多个样品，用一次性96孔板， 操作非常便捷，还能减少比色皿的误差。
[0044] 将5~50μ1透明质酸(浓度为lyg/yl)加入有200μ1醋酸钠缓冲液1.5ml EP管，不足 250ul的用醋酸钠缓冲液补