紫变青霉ql-9204及在转化根皮苷制备根皮素中的应用
【专利说明】紫变青霉QL-9204及在转化根皮音制备根皮轰中的应用 (-)技术领域
[0001]本发明设及一种根皮素的制备方法，特别设及一株紫变青霉（Penici Ilium pu巧u;rogeruim)Qk9204，W及该菌株在转化根皮巧制备根皮素领域中的应用。 (二)【背景技术】
[0002]根皮素(phloretin)，又名Ξ径苯酪丙酬，CAS号60-82-2,属于二氨查尔酬化合物。 化学结构为3-(4-?基苯基)-1-(2、4、6-Ξ径基苯基)-1-丙酬，分子式为Cl出14〇5,分子量为 274.27,纯品为粉红色，易溶于甲醇、乙醇和丙酬，几乎不溶于水，可溶于碱性溶液。根皮素 具有很好的抗氧化、抗自由基作用，能抑制黑色素细胞活性，对色斑有很好的淡化作用；不 仅如此，根皮素还具有很好的抗炎和免疫抑制作用；最新研究表明根皮素还具有抗肿瘤W 及抗癌活性。
[0003] 根皮素自然存在的形态多是W糖巧形式存在，即根皮巧(phlorizin, CAS号60-81- 1)。根皮巧广泛存在于苹果、慕枝等水果中，主要集中在运些植物中的根茎或根皮中。生产 根皮素的方法可W采用有机化学方法合成，也可W通过天然的根皮巧经酸碱水解或酶解法 获得。目前，有专利报道采用酸碱水解或酶解的方法转化根皮巧为根皮素，但运些技术的应 用有一定的限制，如采用酸碱水解法，虽然具有成本低的优势，但存在酸碱残留、转化专一 性差和产品需脱色等不足;采用酶解法则需要商品水解酶，且酶不能回收重复利用，导致工 艺成本过高。
[0004] 微生物有着非常强大的酶系和分解转化物质的能力，如果能筛选出转化专一性强 的微生物，发酵产生的相应的糖巧酶，用滤除菌体的粗酶液作为转化体系，根皮巧在粗酶液 中糖巧酶的作用下转化为根皮素，可W克服酸碱水解和酶解法的不足，因此具有反应条件 溫和、专一性强、生产成本低和环境友好等优点。 (Ξ)
【发明内容】
[0005] 本发明目的是提供一株产生糖巧酶的微生物菌株一紫变青霉（Penicillium pu巧urogenum)Qk9204,及其在转化根皮巧制备根皮素中的应用，较好地克服现有酸碱水 解法和酶解法制备中专一性差和转化得率低的问题，本工艺具有成本低、流程简单、转化得 率高和转化副产物少等优点。
[0006 ]本发明采用的技术方案是：
[0007] 本发明提供一株新菌株一紫变青霉(Penici 11 ium purpurogenum)化-9204，保藏 于中国典型培养物保藏中屯、，保藏编号：CCTCC No:M 2015781，保藏日期2015年12月25日， 地址：中国，武汉，武汉大学;邮编:430072。
[0008] 本发明所述紫变青霉化-9204,是从W苹果皮为微生物来源的富集培养物中分离 和筛选得到的优良菌株。所述紫变青霉化-9204的菌落特征如下：接种在马铃馨培养基 (PDA)琼脂平板上，28°C培养2天后，平板表面长出白色絮状的菌丝体，气生菌丝长度在1~ 2mm，菌落边缘呈银齿状不整齐，继续培养3天后，菌落正面逐渐变灰绿色，背面逐渐变为紫 红色。显微镜下观察菌丝抱子丝呈扫靑状，1~2层小梗，分生抱子串呈不分枝的链状，楠圆 形，淡黄色，表面粗糖。
[0009] 所述紫变青霉化-9204的18s rDNA的部分核巧酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0010] SEQ ID N0:1：
[0011]
[0012] 本发明还提供一种所述紫变青霉化-9204在生物转化根皮巧制备根皮素中的应 用，具体所述的应用是W紫变青霉化-9204产酶培养后的发酵液经抽滤获得的滤液为生物 催化剂，W根皮巧为底物，W甲醇为助溶剂构成转化体系（优先选用甲醇溶解根皮巧，然后 再与生物催化剂混合），在28~30°C、200~25化/min条件下进行转化反应，转化反应结束 后，将转化液分离纯化，获得根皮素。
[0013] 进一步，所述底物根皮巧的终浓度为20~80mg/L转化体系，所述助溶剂甲醇的体 积终浓度为2~8ml/L转化体系，所述催化剂用量W抽滤前发酵液中干菌体重量计为2.5~ 6. Og/L转化体系(优选2.5~5. Og/L)。
[0014] 所述紫变青霉化-9204菌株在产酶培养前，通常需要先经斜面培养基活化培养，或 再经过种子培养基扩大培养，然后用抱子或种子液接入发酵培养基进行产酶培养，所述紫 变青霉化-9204产酶培养方法为：（1)活化培养:将紫变青霉化-9204菌种抱子接种于斜面培 养基，于28~30°C恒溫培养2~3天，获得斜面抱子，所述的斜面培养基为马铃馨葡萄糖琼脂 培养基(PDA);PDA培养基组成为：马铃馨100~200g/L(马铃馨洗净去皮，切成小块，加5倍质 量水煮沸20~30min，4层纱布过滤去渣留汁）、薦糖10~20g/L、琼脂15~20g/L，溶剂为水， pH自然，高压蒸汽121°C灭菌15min;(2)种子扩大培养:挑取步骤（1)活化培养后紫变青霉 Qk9204斜面抱子接种至种子培养基中，于28~30°C、200~25化/min恒溫振荡条件下培养2 ~3天，得种子液，所述种子培养基为马铃馨葡萄糖培养基(PDB)，PDB培养液除不含琼脂，其 他成分W及配制方法同PDA培养基；（3)产酶培养:将种子液W体积浓度5~8%的接种量接 种至发酵培养基中，于28°C、200r/min恒溫振荡条件下培养4~5天，获得发酵液;所述发酵 培养基组成为：薦糖2~5g/L，（NH4)2S〇4 4~6g/L，NaCl 5g/L，K此P〇4 5g/L，MgS〇4 Ig/L， MnS〇4 Ig/L，溶剂为水，pH 6~7。
[0015] 进一步，优选所述发酵培养基组成为：薦糖2g/L，（NH4)2S〇4 6g/L，化Cl 5g/L， Κ出P〇4 5g/L，MgS〇4 lg/L，MnS〇4 Ig/L，溶剂为水，pH 为6。
[0016] 进一步，优选所述转化反应的条件为:在28~30°C、200~25化/min恒溫振荡条件 下转化8~15h。
[0017] 本发明所述分离纯化的方法为:在生物转化反应结束后，转化体系用等同体积的 乙酸乙醋萃取3次，合并萃取液于圆底烧瓶中，45°C下减压蒸干乙酸乙醋后，再加入等同原 转化体系体积的甲醇溶解残留物。甲醇溶液用滤纸过滤后，转入另一洁净圆底烧瓶中，45°C 下减压蒸干甲醇后，加少量甲醇溶解残留物，甲醇溶液转入洁净烧杯中，减压干燥后即得淡 黄色粉末根皮素。
[0018] 本发明的有益效果主要体现在：（1)本发明提供一株新菌株一紫变青霉化-9204， 该菌是一株无毒无害，使用安全的菌种；（2)紫变青霉化-9204生长快、抗杂菌能力强、容易 培养，批次稳定；（3)发酵培养基成分简单，市场价格低，从而生产成本较低；（4)本发明将底 物根皮巧直接投入到粗酶液中转化，免去了酶的分离纯化步骤，工艺简单，易于工业化应 用；（5)根皮素的转化得率高，最高可达92.5%，且具有副产物少，产物容易提取等优点。 (四）
【附图说明】
[0019] 图1根皮巧转化为根皮素的化学反应式；
[0020] 图2根皮巧和根皮素 HPLC质量浓度分析的标准曲线，A为根皮巧标准曲线，B为根皮 素标准曲线；
[0021] 图3 HPLC对转化样品的分析图谱。曲线A为标准品根皮巧和根皮素的HPLC图谱；曲 线B为根皮巧转化化的对照样品HPLC图谱；曲线C为根皮巧经生物转化15h后的HPLC图谱(实 施例5样品）。 (五)
【具体实施方式】
[0022] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0023] 实施例1:转化菌株的富集和分离
[0024] 在250mLS角瓶中加入约50g经粉碎的新鲜苹果皮，于28°C恒溫培养5天。将长满霉 菌的富集物用无菌水稀释IX 1〇6倍后涂布于PDA平板培养基上，于28°C恒溫培养3天，挑取 形态和颜色不同的霉菌菌落转接PDA斜面培养基，置于28°C恒溫培养3天，得抱子丰富的斜 面菌株11株，分别予W编号(Qk9201~化-9211)，保藏于4°C冰箱中备用。
[0025] 所述的平板培养基和斜面培养基均为马铃馨葡萄糖琼脂培养基(PDA),按如下组 成和方法配制：马铃馨洗净去皮切成小块，称取200g，加自来水lOOOmL，煮沸30min，4层纱布 过滤去渣，滤液补足到1000mL，再加入薦糖20g、琼脂18g，pH自然(实测6.5)，加热至琼脂溶 化后分装试管或于Ξ角瓶中，经高压蒸汽121°C灭菌15min后搁置斜面或倒入无菌培养皿。
[0026] 实施例2:转化菌株的筛选和分类鉴定
[0027] 用接种环分别挑取实施例1获得的各个菌株斜面菌种的抱子2环，接入lOOmL发酵 培养基中（250mLS角瓶装），于28°C、200;r/min恒溫振荡条件下产酶培养5天后，用布氏漏斗 抽滤，收集的滤液即为粗酶液。取50mL粗酶液置于250mLS角瓶中，Img根皮巧用0.1 mL甲醇 溶解，再加入到粗酶液中构成反应体系(总体积W50mL计），于28°C、200r/min恒溫振荡条件 下转化化后；取转化液lOmL用同等体积的乙酸乙醋萃取2遍，合并乙酸乙醋于圆底烧瓶中， 乙酸乙醋减压蒸干后用山L甲醇溶解残留物，再用0.45WI1微孔滤膜过滤，用高效液相色谱法 化PLC)分析样品中根皮巧和根皮素的浓度。
[0028] HPLC法分析不同菌株发酵制备的粗酶液转化样品中根皮巧和根皮素的浓度，由此 比较不同菌株产酶转化根皮巧为根皮素的能力大小。经过比较，由编号化-9204的菌株发酵 制备的粗酶液转化根皮巧，生成根皮素的摩尔转化得率最高，达到34.7%，转化液中浓度达 至Ij4. llmg/L。
[0029] 将菌株化-9204接种在PDA平板培养基上，28°C培养2天后，平板表面长出白色絮状 的菌丝体，气生菌丝长度在1~2mm，菌落边缘呈银齿状不整齐，继续培养3天后，菌落正面逐 渐变灰绿色，背面逐渐变为紫红色。显微镜下观察菌丝抱子丝呈扫靑状，1~2层小梗，分生 抱子串呈不分枝的链状，楠圆形，淡黄色，表面粗糖。
[0030] 该菌株交由生工生物工程（上海）有限公司进行18S rDNA测序，测得序列大小为 1318bp (SEQ ID NO: 1所示）。将该序列在GenBank上进行BLAST比对，与30株W上的紫变青霉 菌株的18S rDNA序列有99% W上的同源性。综合化-9204菌株的形态特征和18S rDNA的序 列分析，可W确定化-9204菌株为一株紫变青霉(Penicillium pu;rpu;rogenum)，定名为紫变 青霉化-9204,已保藏于中国典型培养物保藏中屯、，保藏编号:CCTCC No :M 2015781，保藏日 期2015年12月25日。
[0031 ]所述的PDA平板培养基组成和制备方法同实施例1。
[0032] 所述的发酵培养基按如下组成和方法配制：薦糖5g/L，蛋白腺5g/L，NaCl 5g/L， Κ此P〇4 5g/L，MgS〇4 lg/L，MnS〇4 Ig/L，溶剂为水，pH 7,250mL的Ξ角瓶装lOOmL发酵培养 基，8层纱布扎口，高压蒸汽121°C灭菌15min。