一种高产漆酶的粗毛栓菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及微生物，特别是一种高产漆酶的粗毛栓菌及其应用。
【背景技术】
[0002] 漆酶(Laccase，EC 1.10.3.2)是一类含铜离子的多酪氧化酶，能催化一大类酪类 及非酪类化合物的聚合、分解及转化，期间伴随单电子的转移将分子氧还原成水。其首次报 道是日本学者化shida在1883年从日本漆树的流出液中分离得到故得名，之后的研究发现， 漆酶广泛存在于自然界中，尤其是植物、真菌中，此外在细菌、动物、昆虫中也发现漆酶的存 在。漆酶作用底物非常广泛，它能降解木质素，可与有毒的酪类物质作用，使苯氧基类除草 剂、石油工业废水去除毒性，还可W氧化降解一些有机憐毒物，W及在微生物菌体形态形成 和植物病原等方面的功能，由于其催化生成的产物不污染环境，因此在食品工业、环境保 护、造纸工业及其它领域具有很大的研究价值和应用潜力。在近130年的时间里，漆酶作为 一种环境友好型的生物催化剂(利用氧的参与，副产品是水)逐渐成为生物、化学、环境、食 品等领域的研究热点。
[0003] 在真菌中，担子菌口的白腐真菌是自然界中漆酶的主要生产者，大部分的白腐真 菌分泌的漆酶为胞外漆酶。白腐真菌在真菌中占有重要的地位，它们不像高等植物那样靠 光合作用来获得营养，也不像动物那样靠进食、消化获得营养，它们主要是通过吸收腐生物 中的营养物质来供其生长、代谢。常见的白腐真菌有栓菌属（Trametes)、侧耳属 (Pleurotus)、木耳属（Auricularia)、密孔菌属（Picnoporus)、伞菌属（Agaricus)等。栓菌 (化ametes)是一类能有效地降解木质纤维素及多种难降解的苯酪类有机物的丝状真菌，它 能用于研究植物生物质利用和自然界有机污染物的生物治理。粗毛栓菌HTC (T. gall icaHTC)是一株可分泌漆酶的白腐丝状真菌，比其它许多真菌，如香茹 (Xentinula)、平革菌(Phanerochaete)、侧耳菌（Pleurotus)等能更有效地降解木质素，并 具有很高的木质纤维素降解酶活性，可作为生物制浆、纸浆漂白、环境保护等方面的工业生 产理想候选菌。因此，筛选得到天然的漆酶高表达菌株，探索漆酶新的应用领域和应用途 径，必将具有实际意义和巨大的经济效益。
【发明内容】
[0004] 针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种高产漆酶的 粗毛栓菌及其应用，可有效解决高产漆酶，满足工业生产中对漆酶的需要问题。
[000引本发明解决的技术方案是，一种高产漆酶的粗毛栓菌，分类命名为粗毛栓菌 (Trametes hirsuta化LH237，2015年12月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中屯、，保藏号CGMCC No. 11811，保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号；该 粗毛栓菌可有效用于制备并高产漆酶，实现粗毛栓菌在高产漆酶中的应用。
[0006]本发明粗毛栓菌培养基制备简便，原材料来源广泛，价格低廉，并且该菌株在运种 培养基培养条件下可产生高活性的漆酶，与现有资料相比该菌株酶活是现有报道的其它粗 毛栓菌最高酶活的10倍左右，同时也明显高于同类其它白腐真菌的漆酶酶活，有显著的经 济和社会效益。
【具体实施方式】
[0007] W下结合实施例对本发明的【具体实施方式】作详细说明。
[000引本发明是提供一种高产漆酶的粗毛栓菌，分类命名为粗毛栓菌（Trametes hirsuta)ZLH237,2015年12月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 屯、，保藏号CGMCC No. 11811，保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号;该粗毛栓菌 可有效用于制备并高产漆酶，实现粗毛栓菌在高产漆酶中的应用。
[0009] 本发明在具体实施中： 菌种的生产:本发明所提供生产粗毛栓菌(Trametes hirsuta)化H237菌种的方法，将 粗毛栓菌(Trametes hirsuta化LH237接种于PDA(去皮马铃馨200 g,薦糖（或葡萄糖）20 g，K肥P04 3 g，MgS04?7H20 1 g，VBl 0.02 g，琼脂 15~20 g)平板上，放置30°C培养箱中 培养3-4天备用； 液体发酵和漆酶粗酶液制备:本发明的粗毛栓菌(Trametes hirsu化化LH237用于发酵 生产漆酶。本发明提供了一种利用粗毛栓菌(Trametes hirsu化化LH237发酵生产漆酶的方 法。本发明所提供的发酵生产漆酶的方法，包括在液体基础产酶培养基中培养粗毛栓菌 (Trametes hirsu1:a化L肥37,收集漆酶发酵液的步骤； 上述生产方法中，每升所述液体基础产酶培养基可按照如下方法配制:化此Κ)4· 12此0 0.039%，]\^5〇4.7此0 0.05%，班巧酸钢0.118%，尸65〇4.7出0 0.00315%，(：曰(：12.2此0 0.01〇/〇， 1115〇4，此0 0.0035%，邸3(：00化，3此0 0.0408%，(：〇(：12，細2〇 0.006%，2115〇4,7此0 0.0028〇/〇， CuS〇4'5此0 0.0168%，吐溫80 0.2 mL，玉米粉20.0g，小麦教皮6g，酒石酸锭2g，维生素 Β1 10 yg，维生素 B2 5 yg，维生素 B6化邑； 将培养好的菌株菌种用无菌打孔器制成1cm2左右的菌饼，取2块菌饼于灭菌的液体基 础产酶培养基中，250mLS角瓶加入lOOmL液体基础产酶培养基（121°C、25分钟高压灭菌）， 黑暗培养，培养6-10天，4°C下1500化pm离屯、5min，离屯、取上清液即为漆酶粗酶液； 上述发酵生产漆酶的方法中，所述培养采用的培养溫度可为25°C-35°C，pH为6-8,转速 为120-210,培养时间可为6-10天。
[0010] 实验证明，本发明所提供的粗毛栓菌(Trametes hirsu化化LH237在液体基础产酶 培养基中，30°C、pH6，ISOrmp震荡培养6-lOd，每毫升发酵液中的漆酶活性为1242.22U/I吐； 粗毛栓菌(Trametes hirsuta化LH237在2，5二甲基苯胺发酵培养基(2，5二甲基苯胺发酵培 养基是向液体发酵培养基中加入2，5二甲基苯胺溶液至2，5二甲基苯胺终浓度为0.01%- 0.2%的液体培养基）中30°C发酵6-lOd，粗毛栓菌（Trametes hirsu化)ZL肥37的胞外漆酶产 量为2500-2900U/ mL。
[0011] 本发明所提供的粗毛栓菌培养基制备简便，原材料来源广泛，价格低廉，并且该菌 株在运种培养基培养条件下可产生高活性的漆酶，与现有资料相比该菌株酶活是现有报道 的其它粗毛栓菌最高酶活的10倍左右，同时也明显高于同类其它白腐真菌的漆酶酶活。
[0012] 粗毛栓菌（Trametes hirsu1:a化L肥37筛选及鉴定 1、菌株的分离筛选 采取河南省境内树木的枯木枝上，分离得到Ξ株真菌菌株命名为化H237、ZLH238和 ZLH239，将获得的菌株通过液体发酵进一步筛选产漆酶活性较高的菌株； 将分离纯化的菌株化H237化H238和化肥39接种于PDA培养基平板上，放置30°C培养 箱中培养4-5天备用。将培养好的菌株用无菌打孔器制成1cm2左右的菌饼，取2块菌饼于灭 菌的液体基础产酶培养基中，250mLS角瓶加入lOOmL基础产酶培养基，30°C，摇床18化/ min,黑暗培养。培养6-10天后4°C下1500化pm离屯、5min，离屯、取上清液即为粗酶液。上述实 验重复3次； 2、 漆酶活性测定 将步骤1得到Ξ种菌株的粗酶液分别按照下述方法进行漆酶活性测定： 本实验采用ABTS法测定漆酶酶活，反应体系为2mL，含PH4.0酒石酸缓冲液（酒石酸 1.5009g/100mL和酒石酸钢2.301g/100mL)lmL，蒸馈水0.78mL、发酵酶液20ul和ABTS( 0.137g ABTS用50血蒸馈水溶解200ul，终浓度为500yM)，30°C水浴，反应30s，于420nm处测 定光吸收值，每组Ξ个重复。酶活性定义:每min催化产生山mo 1的NADH或NADPH的量为一个 酶活单位，即?υ/ιΛ; 实验结果表明真菌菌株ZL肥37每毫升发酵液的漆酶活性是1242.22-1500U/mL，ZL肥38 和化!1239的漆酶活性分别为634.81 1]/1111^和441.5 1]/1111，因此对漆酶酶活较高的菌株 ZL肥37进行生物学鉴定； 3、 菌株鉴定 通过菌落形态和分子生物学18s DNA对菌株进行鉴定； 菌落形态特征如下:该菌株菌丝体呈白色，浓密，生长比较快3-4天即可长满平板； 采用通用模板 ITS1(5'TCCGTAGGTGAACCTGCGC3'）和 ITS4 (5' TCCTCCGCTTATTGATATGC3'）进行PCR扩增，扩增产物送华大基因公司进行测序，得到的序 列经校对后提交GenBank，对其序列进行比对分析，通过BLAST序列对比，该菌株与粗毛栓菌 (Trametes Mrsuta)的相似度为99%，因此根据菌落形态和分子生物学测定均鉴定该菌株 为粗毛栓菌（Trametes hirsu1:a)。
[0013] 粗毛栓菌(Trametes hirsu化化L肥37液体培养条件的优化 1、 实验材料 培养基:PDA培养基、基础产酶培养基，组成同上； 2、 不同营养成分对产漆酶酶活的影响 (1)碳源对产漆酶的影响:所选碳源为教皮、大豆粉、可溶性淀粉、葡萄糖、薦糖、麦芽 糖、玉米粉，分别替代基础产酶培养基中的玉米粉、教皮，碳源浓度均为30mg/L，基础产酶培 养基中其它成分不变，每个处理3个重复； 各个处理250mLS角瓶加入50mL基础产酶培养基，高压灭菌。将活化的粗毛栓菌 (Trametes hirsuta化LH237接种于PDA培养基平板上，放置30°C培养箱中培养4-5天备用， 将培养好的菌株用无菌打孔器制成1cm2左右的菌饼，取5块菌饼接入灭菌的基础产酶培养 基中，30°C，摇床18化/min,黑暗培养6-10天。离屯、取上清液即为粗酶液，采用ABTS法测定 漆酶酶活； 结果表明当碳源为玉米粉时菌株漆酶活性最高为1300-1500 U/mL，产漆酶能力明显高 于其它碳源(400U/mL)，其次为可溶性淀粉(150U/mL)，其它碳源酶活性非常低； (2) 氮源对产漆酶的影响:所选氮源为豆巧、酵母粉、蛋白腺、硫酸锭、硝酸锭，酒石酸 锭，分别替代基础产酶培养基中的氮源，碳源为筛选后的最佳碳源玉米粉，基础产酶培养基 中其它成分不变，每个处理3个重复； 各个处理250mLS角瓶加入50mL基础产酶培养基，高压灭菌。将活化的粗毛栓菌 (Trametes hirsuta化LH237接种于PDA培养基平板上，放置30°C培养箱中培养4-5天备用， 将培养好的菌株用无菌打孔器制成1cm2左右的菌饼，取5块菌饼接入灭菌的基础产酶培养 基中，30°C，摇