一种用于全悬浮培养mdck细胞的无血清培养基的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物制品技术领域，具体设及一种用于全悬浮培养MDCK细胞的无血清 培养基。
【背景技术】
[0002] 流感(禽流感)是危害人类健康和养禽业发展的重要传染病，疫苗接种是目前预防 流感(禽流感）的最主要手段之一，传统流感疫苗用鸡胚培养生产，该方法存在制备过程中 微生物污染几率高、产品内毒含量高、注射副反应大、废物有环境污染处理成本高、流感大 流行暴发时鸡胚供应困难和生产周期长等工艺缺点，因此开发安全、高效的动物细胞基质 流感疫苗势在必行。
[0003] MDCK细胞（Madin-Darby canine kidney cells，MDCK)由Madin和Darby于 1958年 从美国Cocker Spaniel母曲架犬的肾脏组织分离培养。是目前公认的适于甲、乙型流感病 毒疫苗生产的理想细胞系之一，已有荷兰苏威制药公司、瑞±诺华公司和美国阿斯利康旗 下的Medimmune公司批准利用MDCK细胞生产流感疫苗。我国也有多家企业正在利用MDCK细 胞进行流感疫苗的研发，但目前还没有自主研发的MDCK细胞生产的流感疫苗上市，原因除 我国企业起步较晚外，MDCK细胞培养个性化培养基也是制约我国细胞基质流感疫苗研发进 程的重要因素。
[0004] 我国许多细胞基质的疫苗正在进行或完成了从传统的转瓶工艺向生物反应器高 密度培养工艺升级转型，生物反应器培养细胞有两种方式，一种是利用细胞本身要贴附在 培养物表面生长的特性进行微载体培养，运种方式要实现大规模培养时工艺路线复杂不容 易掌握，导致的结果是现有条件下培养规模小，在生产中要使用数量很多的小型生物反应 器才能生产任务，由于反应器之间的差异最终导致整个产品有较大的批间差，而且培养工 艺中要使用动物血清提供细胞在微载体上贴附的贴壁因子，增加了生物安全的风险和下游 纯化工艺。第二种将细胞驯化成可全悬浮培养的细胞后进行生物反应器全悬浮培养，目前 用BHK21细胞在口蹄疫疫苗中已全部完成工艺升级，国内生物反应器无血清培养的单罐培 养体积可达3000L，是微载体培养单罐体积的60倍之多。全悬浮培养工艺容易线性放大，而 且还可采用无血清培养基，提高了下游产品的生物安全性，简化了纯化工作，是目前新疫苗 研发的方向。
[000引无血清培养基使用成分明确的血清替代物，不仅简化了下游工艺，也避免了生物 污染风险，但是目前血清成分仍不清楚，况且MDCK细胞本身对培养条件要求高，开发该细胞 无血清培养基一直是该领域研究的重点和难点。
【发明内容】
[0006] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种用于全悬浮培养MDCK细胞的 无血清培养基，为我国流感疫苗生物反应器培养工艺提供支撑。
[0007] 本发明的第一个目的是提供一种用于全悬浮培养MDCK细胞的无血清培养基，所述 培养基由含化Cl为5g/L的DMEM/F12培养基和w下组分组成：亚锡酸钢;重组人表皮细胞生 长因子化GF);氨化可的松;重组全链膜岛素;前列腺素化1);人转铁蛋白；甲状腺素(T3);维 生素 E;胆固醇；乙醇胺;β-琉基乙醇；吐溫-80; Η评ep 1510;重组人血白蛋白ACF;甘露醇糖。
[0008] 作为优选，所述培养基由含NaCl为5g/L的DMEM/F12培养基和W下组分组成：
[0009] 微量元素：
[0010] 亚锡酸钢 0.000001-0.0 OOOlg/L
[OOU] 生长因子；
[0012] 重组人表皮细胞生长因子化GF) 0.00005-0.0005g/L
[0013] 氨化可的松 0.000012-0.00006g/L
[0014] 重组全链膜岛素 0.001-0.0 lg/L
[0015] 前列腺素化 1) 0.00001-0.00005g/L
[0016] 人转铁蛋白 0.002-0.008g/L
[0017] 甲状腺素(T3) 1-5X10-1 VL
[0018] 脂类复合物：
[0019] 维生素 E 0.00001-0.0 OOlg/L
[0020] 胆固醇 0.00001-0.0 OOlg/L [0021 ]乙醇胺 0.0005-0.0 Olg/L
[0022] β-琉基乙醇 0.0005-0.0 Olg/L
[0023] 吐溫-80 0.005-0.0 lg/L
[0024] 植物水解物：
[00 巧]Hy化pl510 1-lOg/L
[0026] 重组人血白蛋白：
[0027] ACF 0.5-5g/L
[002引 其它；
[0029] 甘露醇糖 0.5-5g/L。
[0030] 作为进一步优选，所述培养基由含化Cl为5g/L的DMEM/F12培养基和W下组分组 成：
[0031 ] 微量元素：
[0032] 亚锡酸钢 〇.〇〇〇〇〇5g/L
[0033] 生长因子：
[0034] 重组人表皮细胞生长因子化GF) 0.0 OOlg/L
[0035] 氨化可的松 0.000036g/L
[0036] 重组全链膜岛素 0.005g/L
[0037] 前列腺素 El 0.000025g/L [003引人转铁蛋白0.0047g/L
[0039] 甲状腺素 (T3) 4.0X10-Wg/L
[0040] 脂类复合物：
[0041 ]维生素 E 0.00005g/L [0042]胆固醇 0.00005g/L
[0043] 乙醇胺 0.000925g/L
[0044] β-琉基乙醇 0.000975g/L
[004引 吐溫-80 0.00625g/L
[0046] 植物水解物：
[0047] Hyl^pl510 5g/L [004引重组人血白蛋白：
[0049] ACF 0.5-lg/L
[0050] 其它；
[0051] 甘露醇糖Ig/L。
[0052] 作为优选，所述重组人血白蛋白ACF的浓度为0.5g/L或Ig/L。
[0053] 本发明的第二个目的是提供上述培养基的制备方法，其特征在于:是将脂溶性原 料乳化冻干后与其它原料混合，磨细即得。
[0054] 使用时，用注射用水溶解，每升加2200mg化HC03，定容，用1N氨氧化钢或1N盐酸调 pH值至7.1-7.2,过滤除菌即得。
[0055] 本发明的第Ξ个目的是提供上述培养基的制备方法，其特征在于:将脂溶性原料 乳化后（不需要冻干）与其它原料依次溶解于注射用水，然后每升加入2200mg NaHC〇3,定 容，最后用IN氨氧化钢或IN盐酸调抑值至7.1-7.2,过滤除菌即得。
[0056] 本发明的第四个目的是提供上述培养基在无血清全悬浮培养MDCK细胞中的应用。
[0057] 本发明的第五个目的是提供应用上述培养基全悬浮培养MDCK细胞的方法，在权利 要求1-4任一所述的培养基中直接接种MDCK细胞，不添加血清，在37°C，120rpm的转速下摇 床培养。
[0058] 为了得到全悬浮培养MDCK细胞无血清培养基，本申请人进行了大量实验，在基本 确定了培养基中含有的各项组分后，又对最佳配比进行了大量实验，W下为部分实验过程 及实验结果。
[0059] 本申请人W商品化的DMEM/F12培养基配方为基础，通过调整氯化钢浓度调节渗透 压和添加植物水解蛋白、重组人血白蛋白、生长因子和脂类，设计和优化MDCK悬浮细胞生长 的无血清培养基配方。
[0060] ①预试验一:在DMEM/F12培养基直接加下列添加物(单位:g/L):
[0061] 微量元素：
[0062] 亚锡酸钢（Na2Se〇3-甜 2〇) 0.000005
[0063] 生长因子：
[0064] 重组人表皮细胞生长因子化GF) 0.0001 [006引 氨化可的松0.000036
[0066] 重组全链膜岛素0.005
[0067] 前列腺素 E1 0.000025 [006引人转铁蛋白0.0047
[0069] 甲状腺素(T3) 4.0X10-W
[0070] 脂类复合物：
[0071] 维生素 E 0.0002
[0072] 胆固醇 0.0002
[0073] 乙醇胺 0.0037
[0074] β-琉基乙醇 0.0039
[007引吐溫-80 0.025(密度为1.09g/ml，称量时按Ig/ml计）
[0076] 植物水解物：
[0077] Hy 化 pl510 10 [007引重组人血白蛋白：
[0079] ACF 1
[0080] 其它；
[0081] 甘露醇糖1
[0082] 调抑为7