普通生酮基古龙酸菌速生型产酸菌株的高通量筛选方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种微生物菌种选育方法，特别是一种普通生酬基古龙酸菌速生型产 酸菌株的高通量筛选方法。
【背景技术】
[0002] 维生素 C是人体必需的维生素，生理作用广泛，在医药和食品工业中均占有重要地 位。目前国内普遍采用"二步发酵法"生产，第一步:单菌发酵，将D-山梨醇转化成心山梨糖； 第二步:混合菌发酵，通过普通生酬基古龙酸菌Ketogulonogenium vulgarum(俗称小菌)和 巨大芽抱杆菌Bacillus megaterium(俗称大菌）的共同作用将k山梨糖转化成2-酬基-L- 古龙酸;2-酬基-1^-古龙酸再经过提取和转化生成维生素 C。
[0003] 在"二步发酵法"生产维生素 C的过程中混合菌发酵，通过普通生酬基古龙酸菌和 巨大芽抱杆菌的共同作用将k山梨糖转化成2-酬基-k古龙酸是生产维生素 C的关键步骤， 它决定着维生素 C的发酵产率和成本，在此过程中，普通生酬基古龙酸菌是产酸菌，巨大芽 抱杆菌是伴生菌，不产酸，因此选育普通生酬基古龙酸菌速生型产酸菌株，缩短发酵周期， 就成为节能降耗、提高设备利用率、增大维生素 C产量的关键。
[0004] 但是普通生酬基古龙酸菌的产酸性能受多基因控制，需要经过多轮次的诱变选育 和大覆盖面的批量筛选才能得到正突变菌株，通常使用的筛选方法为:将经过诱变处理的 菌体悬浮液稀释后均匀涂布于常规的分离培养基平板上培养，然后挑取存活的单菌落采用 划线法进一步富集培养，再分别接种于种液培养基和发酵培养基中进行产酸性能检测，根 据每个菌株的生长产酸情况判定取舍。运样的方法存在W下不足:一是经过诱变处理，即使 是产酸性能得到改变的菌株其菌落形态和菌体形态等表型特征也几乎没什么改变，难W鉴 另IJ，因此对正突变菌株的挑选没有目的性，而为了避免漏选，对诱变后存活的单菌落基本上 是全部选择，筛选量巨大;二是进行菌株生长代谢检测采用的培养容器为装液量和容积比 较大的试管或Ξ角瓶，要求待检菌株的量也相应较大，需要先将单菌落做富集培养，运样不 仅又增加了 3天左右的培养时间，而且还增加培养装置。基于上述原因，为了简化筛选工艺、 提高筛选效率和准确性，建立一套新的普通生酬基古龙酸菌速生型产酸菌株的高通量筛选 方法，就成为当前亟待解决的问题。
【发明内容】
[000引本发明的目的在于克服上述现有普通生酬基古龙酸菌速生型产酸菌株选育技术 的不足，而提供一种基于特征指示剂鉴别与离屯、管组培养技术相结合、简便、快速、高效高 通量选育普通生酬基古龙酸菌速生型产酸菌株的方法，即一种普通生酬基古龙酸菌速生型 产酸菌株的高通量筛选方法。
[0006] 本发明的目的可W通过下述的技术方案来实现：
[0007] 运种基于特征指示剂鉴别与离屯、管组培养技术相结合、简便、快速、高效高通量选 育普通生酬基古龙酸菌速生型产酸菌株的方法，包括如下步骤：
[000引（1)w普通生酬基古龙酸菌化etogulonogenium vulgarum)为出发菌株进行诱变 处理，获取经诱变处理的菌体悬浮液；
[0009] (2)将经过诱变处理的菌体悬浮液稀释后涂布于含有一定剂量指示剂的鉴别用固 体培养基平板上，31 ± 3°C静置培养48~96h;
[0010] (3)从鉴别用固体培养基平板上生长出的普通生酬基古龙酸菌单菌落中挑取在静 置培养期内周围培养基出现变色圈且颜色由蓝绿变为黄色的单菌落，分别接种于一支装有 含有一定剂量指示剂的鉴别用种液培养基的离屯、管中，每N支离屯、管组成一个离屯、管组，作 为一个培养单元置于摇床中，31 ±3°C振荡培养，期间根据离屯、管中种液的颜色变化，挑取 在较短时间内颜色由蓝绿变为黄色的离屯、管中种液作为高产酸种液；
[0011] (4)将挑取的高产酸种液稀释后涂布于分离培养基平板上，31±3°C静置培养48~ 72h，挑取饱满个大的单菌落进行扩大培养，即得到纯化高产的普通生酬基古龙酸菌速生型 产酸菌株；
[0012] 所述鉴别用固体培养基的组成为：山梨糖10~20g/L、酵母膏2~6g/L、玉米浆2~ 6g/L、蛋白腺5~lOg/L、尿素0.5~2g/L、MgS〇4 · 7此0 0.05~0.2g/L、K此P〇4 0.5~2g/L、 CaC03 0.5~2g/L、指示剂0.01~0.1g/L、琼脂10~化g/L，pH7.0~7.5;
[0013] 所述鉴别用种液培养基的组成为：山梨糖10~20g/L、酵母膏2~6g/L、玉米浆2~ 6g/L、蛋白腺5~lOg/L、尿素0.5~2g/L、MgS〇4 · 7出0 0.05~0.2g/L、K出P〇4 0.5~2g/L、指 示剂0.005~0.05g/L，pH6.8~7.2;
[0014] 所述鉴别用固体培养基和鉴别用种液培养基中加入的指示剂可W是漠百里酪蓝， 或加有适量漠甲酪紫的漠百里酪蓝、漠甲酪紫混合物，或加有适量甲基红的漠百里酪蓝、甲 基红混合物，或加有适量漠甲酪紫和甲基红的漠百里酪蓝、漠甲酪紫、甲基红混合物。
[0015] 本发明所提供的运种普通生酬基古龙酸菌速生型产酸菌株的高通量筛选方法，它 基于特征指示剂鉴别与离屯、管组培养技术相结合，特征指示剂鉴别是在鉴别用的固体培养 基和鉴别用的种液培养基中加入一定剂量的指示剂，空白的鉴别用固体培养基和空白的鉴 别用种液培养基颜色呈蓝绿色，当接入普通生酬基古龙酸菌单菌落后，随着菌株的生长和 代谢产酸，菌株周围的培养基pH逐渐下降，颜色逐渐变黄，而且菌株生长产酸越快颜色变化 越早，产酸量越高变色范围越大越偏黄，反证菌株生长越快、产酸量越高；离屯、管组培养是 采用圆底离屯、管均匀排布在离屯、管盒中，组成离屯、管组，各离屯、管中装入鉴别用种液培养 基，116°C± 2°C灭菌30min，自然冷却，再分别无菌接入挑取的普通生酬基古龙酸菌单菌落， 然后置于摇床上一同进行振荡培养。
[0016] 本发明的有益效果在于:它通过将经诱变处理的普通生酬基古龙酸菌于固体培养 基平板上培养、并在固体培养基中添加一定剂量的指示剂，实现对普通生酬基古龙酸菌速 生型产酸菌株的简便、快速鉴别;通过设计将挑取的普通生酬基古龙酸菌速生型产酸菌株 接种于种液培养基中培养、并在种液培养基中添加一定剂量的指示剂，实现对挑取的普通 生酬基古龙酸菌速生型产酸菌株的简便、快速确认，再与离屯、管组培养技术结合，在满足了 普通生酬基古龙酸菌单菌落接种培养和检测过程需要独立进行无菌操作要求的同时，又取 得了批量培养的效果，从而达到快速、便捷、准确、高通量的筛选目的，使普通生酬基古龙酸 菌速生型产酸菌株的选育简便、快速、高效。
【附图说明】
[0017] 图1所示本发明实施例1中普通生酬基古龙酸菌菌落在鉴别用固体培养基平板上 生长和菌落周围培养基颜色的变化情况；
[0018] 图2所示本发明实施例2中普通生酬基古龙酸菌菌落在离屯、管组培养中生长和离 屯、管中鉴别用种液培养基颜色的变化情况。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合实施例对本发明作进一步的详述，但本发明的范围并不仅局限于此，其 要求保护的范围记载于权利要求的权项中。
[0020] 本发明实施例应用的培养基如下：
[0021] 鉴别用固体培养基(g/L):山梨糖15、酵母膏3、玉米浆3、蛋白腺8、尿素 l、MgS〇4· 7出0 0.1、KH2P04l、CaC03l、指示剂0.02、琼脂15，pH7.0~7.5。
[002引鉴别用种液培养基(g/L):山梨糖15、酵母膏3、玉米浆3、蛋白腺10、尿素 l、MgS04· 7出0 0.1、K出P04l、指示剂0.01，pH6.8~7.2。
[0023] (常规的）种液培养基（g/L):山梨糖15、酵母膏3、玉米浆3、蛋白腺10、尿素1、 MgS04·7出0 0.1、KH2P04l、CaC03 0.5，pH6.8~7.2。
[0024] (常规的）发酵培养基（g/L):山梨糖80、酵母膏1、玉米浆12、尿素 10、KH2P04 1， MgS04·7出00.1、CaC03 5，pH6.8~7.2。
[002引（常规的）分离培养基（g/L):山梨糖15、酵母膏3、玉米浆3、蛋白腺8、尿素1、 MgS04·7出0 0.1、KH2P04l、CaC03l、琼脂20，pH6.8~7.2。
[0026] 实施例1中，鉴别用固体培养基中加入的指示剂是加有适量漠甲酪紫和甲基红的 漠百里酪蓝、漠甲酪紫、甲基红混合物。
[0027] 实施例2中，鉴别用固体培养基和鉴别用种液培养基中加入的指示剂均是漠百里 酪蓝。
[0028] 实施例1:普通生酬基古龙酸菌速生型产酸菌株的鉴别及其高产酸性能检测
[0029] (1)W普通生酬基古龙酸菌化etogulonogenium vulgarum)为出发菌株进行诱变 处理，获取经诱变处理的菌体悬浮液；
[0030] (2)将经过诱变处理的菌体悬浮液用无菌蒸馈水逐级稀释至10-4,然后吸取0.05~ 0.1 mL均匀涂布于鉴别用固体培养基平板上，31 ± 2°C静置培养96h，期间自静置培养4她开 始每隔化观察一次普通生酬基古龙酸菌菌落生长和菌落周围培养基颜色的变化情况，标记 周围培养基出现变色圈的单菌落，编号原则为变色时间-菌落序号，具体的:培养至56h时有 一株单菌落周围培养基出现偏黄色变色圈，标记该单菌落编号为56-1，7化时有一株单菌落 周围培养基出现偏黄色变色圈，标记该单菌落编号为72-1，继续培养至96h没有新的单菌落 周围培养基出现偏黄色变色圈，如附图1所示；
[0031] (3)用无菌牙签挑取周围培养基出现偏黄色变色圈的单菌落，W划线法转移至分 离培养基平板上进行扩大培养，同时挑取一株周围培养基未出现偏黄色变色圈的单菌落作 为对照，同法进行扩大培养，31±2°C静置培养4她时，在各经扩大培养生长出的普通生酬基 古龙酸菌菌苔上分别搭配相同量的巨大芽抱杆菌(Bacillus megaterium)，31±2°C继续培 养24h取出，得到各普通生酬基古龙酸菌与相同量巨大芽抱杆菌的混合菌斜面；