实施例2 制备的鉴定鸟类性别的LAMP试剂盒的特异性较高，可准确的鉴定鸟类性别。
[0098] 实施例4、实施例2制备的鉴定鸟类性别的LAMP试剂盒的灵敏度
[0099] -、W实施例2制备的鉴定鸟类性别的LAMP试剂盒C进行灵敏度实验，实验重复Ξ 次，每次重复的步骤如下：
[0100] 1、从白冠长尾锥雌鸟的全血中提取基因组DNA，命名为DNA1，基因组DNA浓度为 26.4η 邑/化。
[0101] 2、吸取ImL DNA1加入盛有9ml无菌超纯水中的试管中充分混匀，得到DM2; W此类 推制成DM3和DNA4。使用紫外分光光度计测定稀释后各个梯度的DNA浓度，分别为2.64ngAi L、264pg/yL和26.4pg/yL。
[0102] 3.LAMP
[0103] (1)向试管中加入23化反应试剂C和化L步骤1制备的DNAl得到反应液，然后将反应 液于64°C反应50min。^反应时间为横坐标，W650皿下浊度仪测量的浊度为纵坐标，得到浊 度曲线。
[0104] 按照上述方法，将DNA1分别替换为步骤2制备的DNA2、DNA3、DNA4和灭菌超纯水，其 它步骤均不变，得到相应的浊度曲线。
[0105] (2)结果观察和判定：如果浊度曲线呈现典型的"S型"、则待测鸟类为或候选为雌 性;如果浊度曲线呈现为水平直线、则待测鸟类为或候选为雄性。
[0106] 实验结果见图3,向反应试剂C中加入DNAUDNA2或DNA3进行LAMP均得到典型的"S 型"扩增曲线，而向反应试剂C中加入DNA4或灭菌超纯水进行LAMP得到的扩增曲线均为水平 的直线。
[0107] 二、W实施例2制备的鉴定鸟类性别的LAMP试剂盒D进行灵敏度实验，实验重复Ξ 次，每次重复的步骤如下：
[010引 1、同步骤一中1。
[0109] 2、同步骤一中2。
[0110] 3'LAMP
[0111] 具体的检测方法如下：
[0112] (1)向试管中加入24化反应试剂D加入化L DNA1得到反应液，然后将反应液于64°C 反应50min。反应结束后，观察反应液的颜色变化。
[0113] 按照上述方法，将DNA1分别替换为步骤2制备的DNA2、DNA3、DNA4和灭菌超纯水，其 它步骤均不变。反应结束后，观察反应液的颜色变化。
[0114] (2)结果观察和判定：如果反应液的目测颜色为绿色、则待测鸟类为或候选为雌 性;如果反应液的目测颜色为澄色、则待测鸟类为或候选为雄性。
[0115] 实验结果见图4( 1为DNA1，2为DNA2，3为DNA3，4为DNA4，5为灭菌超纯水），向反应试 剂D中加入DNA1、DNA2或DM3进行LAMP后，反应液为绿色，而向反应试剂D中加入DNA4或灭菌 超纯水的试管进行LAMP后，反应液为澄色。
[0116] 结果表明，本发明提供的鉴定鸟类性别的LAMP试剂盒C和试剂盒D对鸟类基因组 DNA的最小检测限为528pg。
[0117] Ξ、普通PCR检测鸟类基因组DM的灵敏度实验
[0118] 实验重复Ξ次，每次重复的步骤如下：
[0119] 1、同步骤一中1。
[0120] 2、同步骤一中2。
[0121] 3、W化L DNA1为模板，W实施例1制备的引物F3和引物B3为引物，进行PCR，得到 PCR扩增产物。
[0122] 按照上述方法，将DNAl分别替换为步骤2制备的DNA2、DNA3、DNA4和灭菌超纯水，其 它步骤均不变，获得相应的PCR扩增产物。
[0123] 4、结果观察和判定:如果PCR扩增产物含有24化P的DNA片段、则待测鸟类为或候选 为雌性;如果PCR扩增产物不含有24化P的DNA片段、则所述待测鸟类为或候选为雄性。所述 240bp的DNA片段如序列表中序列7自5 '末端起第266位至505位所示。
[0124] 实验结果见图5 (1 为DNA1，2为DNA2，3为DNA3，4为DNA4，5为DNA5，Μ为DNA Marker)。 WDNA1为模板获得的PCR扩增产物中含有240bp的DNA片段，WDNA2、DNA3、DNA4或无菌超纯 水为模板获得的PCR扩增产物中不含有24化P的DNA片段。可见，普通PCR对鸟类基因组DNA的 最小检测限为52.8ng。
【主权项】
1. 一种成套引物，由引物FIP、引物BIP、引物LF、引物LB、引物F3和引物B3组成； 所述引物FIP为如下(al)或(a2): (al)序列表的序列1所示的单链DNA分子； (a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同 功能的DNA分子； 所述引物BIP为如下(bl)或(b2): (bl)序列表的序列2所示的单链DNA分子； (b2)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同 功能的DNA分子； 所述引物LF为如下(cl)或(c2): (cl)序列表的序列3所示的单链DNA分子； (c2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同 功能的DNA分子； 所述引物LB为如下(dl)或(d2): (dl)序列表的序列4所示的单链DNA分子； (d2)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同 功能的DNA分子； 所述引物F3为如下(el)或(e2): (el)序列表的序列5所不的单链DNA分子； (e2)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同 功能的DNA分子； 所述引物B3为如下(Π )或(f2): (Π )序列表的序列6所示的单链DNA分子； (f2)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同 功能的DNA分子。2. 如权利要求1所述成套引物，其特征在于:所述成套引物中，所述引物FIP、所述引物 BIP、所述引物LF、所述引物LB、所述引物F3和所述引物B3的摩尔比为8:8:4:4:1:1。3. 如权利要求2所述成套引物，其特征在于:所述成套引物中，各引物的量如下：1.6μ mol所述引物FIP、1.6ymol所述引物ΒΙΡ、0.8μπιο1所述引物LF、0.8ymol所述引物LB、0.2ymol 所述引物F3、0 · 2μπιο 1所述引物B3。4. 权利要求1至3中任一所述成套引物在制备用于鉴定鸟类性别的试剂盒或鉴定鸟类 性别中的应用。5. 含有权利要求1至3中任一所述成套引物的试剂盒。6. 权利要求5所述试剂盒的制备方法，为如下（Ι)、（Π )或0Π ): (I)所述成套引物中各条引物分别单独包装； (Π )所述成套引物中各条引物按照权利要求2所述比例混合在一起； 0Π )所述成套引物中各条引物按照权利要求3所述量混合在一起。7. 权利要求5所述试剂盒在鉴定鸟类性别中的应用。8. 如权利要求4或权利要求7所述的应用，其特征在于:所述鸟类为白冠长尾雉。9. 一种鉴定待测鸟类性别的方法，包括如下步骤： 提取待测鸟类的基因组DNA，以权利要求1至3中任一所述成套引物进行环介导等温扩 增，然后进行如下评判：如果所述成套引物可以实现对所述基因组DNA的环介导等温扩增， 则所述待测鸟类为或候选为雌性;如果所述成套引物不能实现对所述基因组DNA的环介导 等温扩增，则所述待测鸟为或候选为雄性。10. 如权利要求9所述的方法，其特征在于:所述鸟类为白冠长尾雉。
【专利摘要】本发明公开了一种鉴定鸟类性别的LAMP试剂盒及其专用引物。本发明所提供的鉴定鸟类性别的LAMP试剂盒的专用引物由引物FIP、引物BIP、引物LF、引物LB、引物F3和引物B3组成，各条引物均为单链DNA分子，核苷酸序列依次为序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。实验证明，本发明提供的一种鉴定鸟类性别的LAMP试剂盒及其专用引物能准确的鉴定鸟类性别，且具有耗时短、操作简单和灵敏度高的优点，具有重大的应用价值。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105543221
【申请号】CN201610104938
【发明人】李巍, 陈明非, 刘佳, 杨卓, 王德强, 程淑晶, 高东梅, 李奉京
【申请人】大连市动物疫病预防控制中心, 北京蓝谱生物技术开发有限公司
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2016年2月25日