双抗性CRISPR/Cas9载体及应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及基因工程领域，具体地说，设及一种新型的双抗性CRISPR/化s9载体及 应用。
【背景技术】
[0002] 水稻作为农作物基因功能研究的模式植物，与其相关的遗传学和分子生物学研究 一直受到研究者们的重视。通过转基因获得目标基因改良的水稻成为研究水稻基因功能的 主要手段。虽然水稻的转基因技术在目前已经成熟，但是通过转基因获得的水稻材料由于 无法去除转入的外源T-DNA，经常会对实验结果造成不良影响，也增加了实验结果的不确定 性和实验过程的复杂性。
[0003] 目前对于基因的编辑技术飞速发展。近两年来，由CRISPR/化s9系统介导的基因编 辑技术成为生物界获得基因敲除突变体的主流技术。该系统来源于细菌的免疫系统，其工 作原理是crRNA(CRISPR-derived RNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activating RNA) 结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶化s9蛋白在与crRNA配对的序列祀 位点剪切双链RNA。而通过人工设计运两种RNA，可W改造形成具有引导作用的sgRNA(shod guide RNA)，引导化s9对DNA定点切割。通过人工合成与祀基因序列同源的sgRNA，可W直接 实现对目标基因的编辑，并且运种基因的被编辑状态可W稳定遗传到下一代，无需CRISPR/ Cas9外源T-DNA的持续存在。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种新型的双抗性CRISPR/tas9载体及应用。
[0005] 本发明的另一目的是提供不含有外源T-DNA序列的水稻CRYla基因纯合突变体植 株的构建方法。
[0006] 为了实现本发明目的，本发明的一种双抗性CRISPR/Cas9载体，其是通过PCR扩增 35S启动子和N0S终止子序列，利用重叠 PC时尋35S启动子和N0S终止子序列与体外合成的3X flag序列串联起来，将串联序列插入到载体pFG巧941的EcoRI和化ndlll位点之间，得到载 体I;通过PCR扩增gypsy绝缘子序列，将扩增得到的序列插入到载体I的EcoRI和化ndlll位 点之间，得到载体II;通过PCR扩增化S-cas9-NLS序列，将扩增得到的序列插入到载体II的 Spel位点，得到载体III;最后通过PCR扩增35S:HPT序列，将扩增得到的序列插入到载体III 的甜al位点，即构建获得双抗性CRISPR/tas9载体。
[0007] 其中，3 Xf lag序列如沈Q ID NO: 1所示，gypsy绝缘子序列如SEQ ID NO: 2所示， 化5-。曰39-化5序列如沈910^:3所示，355:册1'序列如沈910^:4所示。
[000引扩增355启动子和^5终止子序列的引物分别如569 10^:5-6和569 10^:7-8 所示;扩增gypsy绝缘子序列的引物如SEQ ID NO :9-10所示;扩增化S-cas9-NLS序列的引物 如沈Q ID NO: 11-12所示;扩增35S:HPT序列的引物如沈Q ID NO: 13-14所示。
[0009] 本发明双抗性〇?15口3/〔曰39载体的全序列如569 10顯：15所示。该载体可引导外 源序列在宿主中编辑目的祀基因的序列。
[0010] 本发明还提供含有所述双抗性CRISPR/tas9载体的工程菌及转基因细胞系。
[0011] 本发明还提供所述双抗性CRISPR/Cas9载体在获得不含有外源T-DNA序列的转基 因植株中的应用。例如，通过第Ξ方软件对祀基因的目标区域进行预测，然后将预测序列和 U3启动子一同插入到双抗载体中对祀基因进行编辑。
[0012] 具体地，所述应用是针对植物中的目标基因设计基于CRI SPR/Cas9的S排NA序列， 将含有编码所述sgRNA序列的DNA片段克隆到双抗性CRISPR/Cas9载体中，转化植物，用潮霉 素 B筛选阳性转基因植株，再用Basta筛选不含有外源T-DNA序列的阳性转基因植株。
[0013] 本发明还提供一种水稻CRYla基因敲除载体Oscryla-sgRNA，根据水稻CRYla基因 设计基于CRISPR/Cas9的SgRNA序列，将含有编码所述SgRNA序列的DNA片段和U3启动子一起 构建到所述双抗性CRISPR/Cas9载体中（编码所述SgRNA序列的DNA片段位于U3启动子下 游），即得水稻CRYla基因敲除载体Oscryla-sgRNA。
[0014] 其中，SgRNA作用位点的核巧酸序列为5/ -ACAGGCACCTGTCCCAGAACGG-3'。 [001日]本发明水稻〇?￥1日基因敲除载体〇3。巧1日-3肖1?酷的全序列如沈9 10^:23所示。
[0016] 本发明进一步提供一种不含有外源T-DNA序列的水稻CRYla基因纯合突变体植株 的构建方法，采用农杆菌介导的方法，将所述Oscryla-sgRNA载体转入水稻愈伤组织中，用 含诱导剂和农杆菌的AAM培养液进行转化，转化后的材料经过共培养-筛选-分化-生根-转 基因苗的锻炼和移栽，筛选转基因水稻植株，先用潮霉素 B筛选获得阳性转基因植株，再用 Bas化筛选获得不含有外源T-DNA序列的水稻CRYla基因纯合突变体植株。
[0017] 优选地，根据SgRNA作用位点的核巧酸序列设计一对引物，通过PCR法鉴定水稻植 株突变位点；引物序列如SEQ ID NO: 17-18所示。
[0018] 本发明通过将来源于多个不同载体的序列、片段经过酶切连接插入到pFG巧941的 序列中，最终构建得到同时具有潮霉素 B(hygromycin)和Basta抗性的双抗载体，利用 hygromycin在转化过程中筛选，利用Basta在后代植株中进行不含有外源T-DNA序列的后代 转基因植株的筛选。
[0019] 本发明所述载体可通过使用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电穿孔 等常规生物技术方法导入植物细胞中（Weissbach，1998，Method for Plant Molecular Biology VIII'Academy Press，New York,第411-463页；Geiserson和Corey,1998，Plant Mole州lar Biologyjnd Edition)。
[0020] 本发明首次利用hygromycin和Basta两种抗性分别作为转基因植株的筛选标记， 为筛选不含有外源T-DNA序列的转基因后代提供了一种可行方式，避免通过复杂的分子生 物学检测实验确定外源T-DNA的存在，直接通过对Basta抗性的筛选和表型结合即可获得不 含有外源T-DNA序列的后代转基因植株。
【附图说明】
[0021] 图1为本发明实施例1中构建的双抗性CRISPR/化s9载体的质粒图谱。
[0022] 图2为本发明实施例2中构建的水稻CRYla基因敲除载体Oscryla-sgRNA的质粒图 谱。
[0023] 图3为本发明实施例3中构建获得的11种不同类型的Oscryla突变体的Oscryla基 因突变位点的测序结果。
[0024] 图4为本发明实施例3中利用Basta筛选Oscryla突变体离体叶片表型的结果，图下 方为通过T-DNA上的特异引物进行PCR检测的结果。
[0025] 图5为本发明实施例3中不含有外源T-DNA序列的Oscryla突变体在蓝光下的叶銷 表型。
【具体实施方式】
[0026] W下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例 均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW, Molecular cloning:a laboratoiy manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0027] 实施例1具有hygroymcin和Basta双抗性CRISPR/Cas9载体的构建 [002引双抗性CRISPR/tas9载体的构建方法如下：
[0029] 从含有35S启动子和N0S终止子序列的载体上，通过PCR扩增35S启动子和N0S终止 子序列，利用重叠 PC时尋35S启动子和N0S终止子序列与体外合成的3 X flag序列串联起来， 将串联序列插入到载体pFG巧941的EcoRI和化ndlll位点之间，得到载体I;从含有gypsy绝 缘子序列的载体上，通过PCR扩增gypsy绝缘子序列，将扩增得到的序列插入到载体I的 EcoRI和化ndlll位点之间，得到载体II;从含有化S-cas9-化S序列的载体上，通过PCR扩增 化S-cas9-NLS序列，将扩增得到的序列插入到载体II的Spel位点，得到载体III;最后从含 有35S:HPT序列的载体上，通过PCR扩增35S:HPT序列，将扩增得到的序列插入到载体III的 甜al位点，即构建获得双抗性CRISPR/tas9载体。
[0030] 其中，3 Xf lag序列如沈Q ID NO: 1所示，gypsy绝缘子序列如SEQ ID NO: 2所示， 化5-。曰39-化5序列如沈910^:3所示，355:册1'序列如沈910^:4所示。
[0031] 扩增355启动子和^5终止子序列的引物分别如569 10^:5-6和569 10^:7-8 所示;扩增gypsy绝缘子序列的引物如SEQ ID NO :9-10所示;扩增化S-cas9-NLS序列的引物 如沈Q ID NO: 11-12所示;扩增35S:HPT序列的引物如沈Q ID NO: 13-14所示。
[0032] 构建获得的双抗性CRISPR/Cas9载体的质粒图谱见图1，载体的全序列如SEQ ID NO: 15所