>[0070] OsMADSH基因核巧酸序列如序列表中序列1所示，其编码序列如序列表中序列1的 自5 '末端第1-741位核巧酸所示。
[0071] OsMADSlS基因核巧酸序列如序列表中序列2所示，其编码序列如序列表中序列2的 自5 '末端第1-807位核巧酸所示。
[0072] OsMADSlS基因核巧酸序列如序列表中序列3所示，其编码序列如序列表中序列3的 自5'末端第1-750位核巧酸所示。
[0073] 0SMADS20基因核巧酸序列如序列表中序列4所示。
[0074] 1、提取水稻品种中花11的基因组DNA并W其作为模板，W人工合成的P1 -Smal和 P2-地al为引物进行PCR扩增，回收PCR扩增产物1。
[0075] P1 -Sma1:5 ' -GGCCCGGGGTCGCGCTCATCATCTTCTC-3 '（下划线部分为SmaI 的识别序 列，其后的序列为序列1的第127-146位）；
[0076] P2-Hpa1:5 ' -GCGTTAACAGTGACTTTTCCTTCCGTTG-3 '（下划线部分为HpaI 的识别序 列，其后的序列为序列1的第463-482位的反向互补序列）。
[0077] 2、用限制性内切酶Smal和化al双酶切PCR扩增产物1，回收酶切产物1。
[0078] 3、用限制性内切酶Smal和化al双酶切载体地Intron，回收约3500bp的载体骨架1。 [0079 ] 4、将酶切产物1和载体骨架1连接，得到重组质粒1。
[0080] 5、W步骤1提取的水稻品种中花11的基因组DNA为模板，W人工合成的P3-Hind虹 和Ρ4-ΚρηΙ为引物进行PCR扩增，回收PCR扩增产物2。
[0081 ] P3-Hind虹：5 ' -GGAAGCTTGTCGCGCTCATCATCTTCTC-3' (下划线部分为Hind虹的识别 序列，其后的序列为序列1的第127-146位）；
[0082] Ρ4-Κρη 1:5 ' -GCGGTACCAGTGACTTTTCCTTCCGTTG-3 '（下划线部分为ΚρηI 的识别序 列，其后的序列为序列1的第463-482位的反向互补序列）。
[0083] 6、用限制性内切酶化nd虹和ΚρηΙ双酶切PCR扩增产物2，回收酶切产物2。
[0084] 7、用限制性内切酶化nd虹和ΚρηΙ双酶切重组质粒1，回收约3.化b的载体骨架2。
[00化]8、将酶切产物2和载体骨架2连接，得到重组质粒2。
[0086] 9、用限制性内切酶ΚρηΙ和SacI双酶切重组质粒2,回收约36化P的酶切产物3。
[0087] 10、用限制性内切酶ΚρηΙ和SacI双酶切载体PU1301，回收约3.9kb的载体骨架3。 [008引11、将酶切产物3和载体骨架3连接，得到重组质粒Ai。
[0089] 根据测序结果，对步骤11获得的重组质粒Ai进行结构描述如下：将载体PU1301的 ΚρηΙ识别序列和SacI识别序列间的DNA小片段替换为核巧酸序列是序列表的序列5所示的 DNA分子。重组质粒Ai在RNA水平上就可W形成如序列表序列6所示的双链RNA，引发RNAi，从 而可用于抑制OsMADSH基因、0sMADS15基因、OsMADSlS基因和0sMADS20基因的表达。
[0090] 二、水稻的遗传转化
[0091] 1、将步骤一构建的重组质粒Ai通过电击导入根癌农杆菌EHA105,得到重组农杆 菌，命名为EHA105-Ai。
[0092] 2、将EHA105-Ai单克隆接种于20mL含卡那霉素50mg/L和利福平50mg/L的YEB液体 培养基，28°C、220巧m震荡培养12~1化后，然后按2%-4% (体积百分含量)的比例接种于含 乙酷下香酬lOOliM的YEB液体培养基，28°C、220巧m振荡培养至0D6日日值达到0.5左右，得到农 杆菌侵染液。
[0093] 3、中花11种子去壳脱粒，置于lOOmLS角瓶中，加入70% (体积百分比）乙醇水溶液 浸泡30sec，再置于25% (体积百分比）次氯酸钢水溶液中，120rpm震荡灭菌30min，无菌水冲 洗3次，用滤纸吸干水分，然后将种子胚朝下置于诱导培养基上诱导愈伤，30°C全光照诱导7 天，长出的愈伤巧芽后用于水稻转化。
[0094] 4、完成步骤3后，取生长状态较好的胚性愈伤组织，浸泡于步骤2得到的农杆菌侵 染液，28°C、8化pm摇床轻摇愈伤，侵染30min，然后，放在铺有一层灭菌滤纸的共培养培养基 上，25°C暗培养4天。
[00M] 5、取步骤4得到的愈伤组织，置于一次筛选培养基，光照交替培养2周后，更换新的 一次筛选培养基，愈伤组织继续光照交替培养2周，将原愈伤组织上长出的抗性愈伤组织转 移至二次筛选培养基上，光照交替培养2周。
[0096] 6、完成步骤5后，取生长旺盛的抗性愈伤组织，置于分化培养基，光照交替培养3 周，抗性愈伤组织上分化出抗性小芽。
[0097] 7、完成步骤6后，取抗性小芽，置于生根培养基，光照交替培养，得到抗性植株。待 抗性植株长至6~10cm时，进行开放式水培养，长出新根后移栽溫室，得到To代拟转基因水 稻植株。
[0098] 提取步骤7获得的To代拟转基因水稻植株的基因组DNA并W此为模板，采用引物F: 5'-GTCGCGCTCATCATCTTCTC-3'（序列表的序列1的第127-146位）和引物R:5'- GCAGTGACTTTTCCTTCCGTTG-3'（序列表的序列1的第463-484位的反向互补序列)组成的引物 对进行PCR扩增。
[0099] PCR 反应条件:95°C，5 分钟;95°C40 秒，56°C40 秒，72°C40 秒，35 个循环;72°C 延伸 10 分钟。
[0100] 结果显示，能够扩增不能获得大小约为360bp条带的为阳性To代转基因水稻植株。 每个植株即为一个株系。随机选择Ξ个株系，将其命名为LI、L2和L3。
[0101] Ξ、转空载体植株的获得
[0102] 用载体PU1301代替重组质粒Ai进行步骤二，得到转空载体植株。
[0103] 四、To代转基因水稻植株的鉴定
[0104] 1、GUS染色鉴定
[0105] 取组培成苗后30天的L1幼苗、L2幼苗、L3幼苗或转空载体植株幼苗的叶片，进行 GUS染色。
[0106] 图1为L3的叶片的染色结果。实验结果如下：L1、L2和L3的叶片GUS染色后呈蓝色， 转空载体植株的叶片GUS染色后，不产生蓝色物质。可见，L1、L2和L3为转基因水稻植株。
[0107] 2、实时定量PCR扩增
[0108] (1)待水稻（中花11、转空载体植株、L1、L2或L3)的穗子长度为5~10厘米时，取剑 叶叶片，用RNA提取试剂盒(Invitrogen公司产品）提取的RNA，得到叶片组织的RNA。
[0109] (2)w叶片组织的RNA为模板，通过实时定量PCR检测OsMADSH基因、0SMADS15基 因、OsMADSlS基因或0sMADS20基因的相对表达量（WACTIN1基因为内参基因）。
[0110] 鉴定0sMADS14基因的引物为5 ' -ACGGAAGGAAAAGTCACTGC-3 ' 和5 ' - TCCTCTATCCTTTCGCCAGC-3'，目的片段如序列表中序列1自5'末端第465位至第668位所示。
[0111] 鉴定0sMADS15基因的引物为5 ' - TGAGTCCATTTCCGAGCTG-3 ' 和5 ' - TCTTCTGCCTCTCCACCAGT-3'，目的片段如序列表中序列2自5'末端第444位至第532位所示。
[0112] 鉴定OsMADSlS基因的引物为5 ' -CTGCAAAAGCTCATGGAGAC-3 ' 和5 ' - CTGACTCCCCTGATCCTCTT-3'，目的片段如序列表中序列3自5'末端第502位至第676位所示。
[0113] 鉴定0sMADS20基因的引物为5 ' -CCACTAAAGCTGCTGCTCCT-3 ' 和5 ' - GGCAAGCCATTGTTGCTGCT-3'，目的片段如序列表中序列4自5'末端第566位至第7