一种促进还原力再生提高微生物羟化dhea转化效率的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高浓度去氢表雄酮(DHEA)投料条件下促进还原力再生来提高亚麻刺盘孢霉(Colletotrichum Iini)ST_1羟化DHEA为7α，15α-羟基-去氢表雄酮(7α，15a-d1H-DHEA)的方法。
【背景技术】
[0002 ]去氢表雄酮(DHEA)是由肾上腺分泌的一种肾上腺激素硫酸DHEA (DHEAS)的前体物质，在治疗神经系统疾病及机体免疫调节等方面具有广泛的药理活性。DHEA可作为中间体合成许多具有重要生理活性的留体化合物，如7a，15a-di0H-DHEA是合成新型口服避孕药“优思明”的有效成分屈螺酮的前体化合物。由于7a，15a-di0H_DHEA具有重要的药理作用和药用价值，其市场前景十分可观，因此如何提高底物DHEA投料浓度和7a，15a-di0H_DHEA产物得率成为当前留体药物领域研究的一大热点。
[0003]目前，已从自然界中筛选得到多个具有羟化DHEA生成7a，15a-di0H_DHEA能力的菌株。其中，Colletotrichum I ini对DHEA轻化能力最强，在摇瓶培养条件下，底物投料浓度为10g/L时，7a，15a-di0H_DHEA得率能达到30%左右。但由于菌株转化活性不高，高浓度底物对菌体毒害作用强等生物转化的本质问题，造成转化过程中底物投料浓度和产物7a，Ka-di OH-DHEA 得率都比较低 ，这些问题直接成为7a，15a-di0H_DHEA工业生产中的瓶颈。留体的羟化反应是利用了真核细胞线粒体膜上的细胞色素P450的单加氧酶活力，羟化反应的反应式如下:
[0004]底物+NADPH+02—产物+NADP++H20
[0005]由该反应式可知，底物投料浓度、还原力的提供是影响留体羟化反应效率的重要因素。留体羟化过程中，NADPH不断被消耗，不能为羟化反应提供足够的还原力，从而直接影响羟化反应的正常进行。外源添加糖类物质，利用微生物自身代谢途径促进还原力NADPH再生，工艺简单，经济适用。为了解决高浓度底物对菌体的毒害作用，提高产物7a，15a-di0H-DHEA得率，本专利建立了一种分批投加底物结合促进还原力再生，适用于大规模生产的C.lini ST-1转化DHEA的5L发酵罐转化工艺。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种高浓度DHEA投料条件下促进还原力再生来提高C.lini ST-1羟化DHEA生成7a，15a-di0H-DHEA的方法。本发明采用的生产菌株为2012年4月24日保藏于北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏编号为CGMCC N0.650 I的亚麻刺盘孢霉(Colletotrichum lini)ST_l，通过分批加入底物DHEA降低高浓度底物对菌体的毒害作用，同时补加适量的葡萄糖提供足够的营养物质促进还原力再生，最终实现高底物投料浓度、高底物高转化率、高产物得率的要求。
[0007]应用上述微生物转化DHEA生产7a，15a-di0H_DHEA的方法，其步骤如下:
[0008](I)采用保藏号为CGMCC N0.6501 的亚麻刺盘孢霉(Colletotrichum lini)ST_l为生产菌种，25-40°C，120-220r/min条件下活化培养得到种子液，将该种子液涂布到PDA培养基上;
[0009](2)制备C.1ini ST-1菌株的细胞液体培养物:挑取步骤(I)的I3DA固体培养基上的C.lini ST-1菌株一环，接种于已灭菌的装有20-50mL种子培养基的250mL锥形瓶中，培养温度为25-40°C，置摇床上以120-220r/min的转速培养18-30h至对数生长中期，即得到C.liniST-1菌株的细胞液体培养物；
[0010](3)5L发酵罐中菌体生长:将步骤(2)中制备好的细胞液体培养物以8-10% (v/v)的接种量接入装有发酵培养基的5L发酵罐中，装液量为3L。在生长阶段，培养温度为25-400C，罐压设为0.05MPa，转速设为220-300r/min，通气量为0.4-1.0vvm。通过调节发酵罐的通气量、转速和罐压来控制发酵液中溶氧水平保持在10-20%，生长12h后，即得到适宜于DHEA转化的液体培养液；
[0011](4)底物分批投加工艺:精确称取三份5g/L粉末状DHEA，于12h、16h、20h分别投入步骤(3)中的菌体培养液，使底物DHEA投料终浓度为15g/L，以降低高浓度底物的毒害作用。
[0012](5)促进还原力再生工艺:转化18h时，加入15g/L葡萄糖作为还原力再生的营养物质，以促进发酵液中还原力的再生。
[0013](6)DHEA生物转化:在转化过程中，培养温度为25_40°C，罐压设为0.05MPa，通气量为0.8-1.2vvm，转速为300-450r/min，通过调节发酵罐的通气量、转速和罐压来控制发酵液中溶氧水平保持在20-30%。通过发酵罐自动流加40%的醋酸或10%的氢氧化钠来维持转化体系的pH为6.5，转化30-48h，即得转化液。
[0014](7)产物检测:将步骤(5)的转化液在8000-12000r/min下离心5-10min，上清用等体积乙酸乙酯抽提7次，沉淀用适量氯仿抽提3次，合并抽提液后于旋转蒸发仪中旋至有晶体出现，乙腈复溶晶体并通过0.22μπι的有机膜过滤除杂，滤液利用高效液相色谱法分析7α，15a-di0H-DHEA 的含量。
[0015]其中步骤(I)中所述的PDA培养基的成分及配比为:土豆200-500g/L;葡萄糖20-50g/L;酵母粉2-10g/L;琼脂粉10-20g/L;pH自然，在121°C高压蒸汽下灭菌20min;步骤(2)所述种子培养基的成分及配比为:花生饼粉5_15g/L，葡萄糖20-50g/L;KCl l_5g/L;酵母粉10-30g/L；K2HPO4 0.1-5.0g/L；MgS04.7H20 0.l-5g/L；FeSO4.7H20 g/L;灭菌前调培养基的pH至6.5-7.5，在121°C高压蒸汽下灭菌20min;步骤(3)所述发酵培养基的成分及配比为:葡萄糖20-50g/L;酵母粉10-30g/L;玉米浆3-10g/L;121°C高压蒸汽下灭菌20min。步骤(4)所述补加葡萄糖成分及配比为:葡萄糖15g/L，121°C高压蒸汽下灭菌20min。
[0016]本发明所述利用亚麻刺盘孢霉(Colletotrichum lini)ST_l转化DHEA为7a，15a-d1H-DHEA的5L发酵罐工艺研究，首次将底物投料浓度提高至15g/L，并且能达到高底物转化率、高产物得率的要求，此方法对微生物转化留体化合物合成留体药物中间体具有重要的借鉴意义。
【附图说明】
[0017]图1高底物投料条件下亚麻刺盘孢霉(Colletotrichum lini)ST_l对DHEA的羟化过程研究。
[0018]图2底物分批投加工艺对DHEA的羟化过程影响的研究。不同底物分批投料方式如下:A)精确称取三份5g/L粉末状DHEA，分别于12、16、20h，分别投入菌体培养液，使底物DHEA投料终浓度为精确称取5g/L粉末状DHEA，于12h投入菌体培养液，8h后投入10g/L底物，使底物DHEA投料终浓度为15g/L<X)精确称取10g/L粉末状DHEA，于12h投入菌体培养液，8h后投入5g/L底物，使底物DHEA投料终浓度为15g/L。
[0019]图3底物分批投料与促进还原力再生工艺相结合的羟化策略对DHEA羟化过程影响的研究。该羟化策略如下:精确称取三份5g/L粉末状DHEA，于12h、16h、20h分别投入的菌体培养液，使底物DHEA投料终浓度为15g/L。转化18h时，加入15g/L葡萄糖。
【具体实施方式】
[0020]实施例1高底物投料条件下亚麻刺盘孢霉(Colletotrichum Iini)ST_1对DHEA的羟化反应的研究
[0021](I)制备C.1ini ST-1细胞液体培养物
[0022]挑取PDA固体培养基上的C.liniST-1接种于装有30mL新鲜液体种子培养基的250mL锥形瓶中，30°C、120-220r/min培养24h。再以8-10%(v/v)的接种量接入装有发酵培养基的5L发酵罐中，装液量为3L。在生长阶段，培养温度为25-40°C，罐压设为0.05MPa，转速设为220-300r/min，通气量为0.4-1.0vvm，溶氧水平保持在10_20 %，生长12h后，即得到适宜于DHEA转化的液体培养液；
[0023](2)DHEA 轻化反应
[0024]精确称取15g/L粉末状DHEA，于12h投入步骤(I)中