一种显示大黄鱼着丝粒和短臂的方法
【技术领域】
[0001 ]本发明属于分子细胞遗传学技术领域，涉及一种染色体基因定位方法，具体是一种显示大黄鱼着丝粒和短臂的方法。
【背景技术】
[0002]大黄鱼(Larimichthys crocea)俗称“黄花鱼”、“黄瓜鱼”，隶属于f卢形目(Perciformes)，石首鱼科(Scieanidae)，黄鱼属(Lar imi chthys)，是暖温水性集群洄游鱼类，主要分布在我国黄海南部、东海、台湾海峡以及南海，是我国近海特有鱼种，系四大海洋经济鱼类之一。其育苗养殖规模、从业人员数量等都居海水养殖鱼类之首。大黄鱼有48条染色体，未发现性染色体。染色体长度较短，24对染色体大小依次递减，染色体之间大小差异不显著。所以有关大黄鱼核型公式的报道不一致，甚至臂比也不相同，表明大黄鱼染色体可能存在多态性。
[0003]有关大黄鱼染色体核型研究报道仍然较少，且多数报道中的染色图像质量较差；基本停留在传统的核型分析，染色体及片段识别仍然很困难。这一现状已不适合当前快速发展的基因组学和功能基因的研究需要。荧光原位杂交是近20年发展起来的技术，使染色体分析进入分子细胞遗传学水平。rDNA编码序列是真核生物基因组中最保守序列之一，弓丨物可以在较高的分类单元中通用。研究资料表明，rDNA可能在基因组中散播，产生新的rDNA位点、多变的rDNA拷贝，甚至与其它一些多基因家族相联系。rDNA是FISH试验中最常用作探针的序列之一。因此，定位rDNA可以为染色体识别提供标志，也可为研究相关物种的染色体进化提供资料。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种显示大黄鱼着丝粒和短臂的方法，用于确定着丝粒的位置，分析染色体核型及研究染色体结构，以解决上述【背景技术】中提出的问题。
[0005]为实现上述目的，本发明提供如下技术方案:
一种显示大黄鱼着丝粒和短臂的方法，包括以下步骤:
(1)染色体制备
提前20h按每克鱼体重于胸鳍基部注射7.5?8.5mg党参的煎汁液和18?20yg BSA混合液，暂养于24?26°C海水中；提前5h再用同样方法注射同样的试剂;提前2.5h按每克鱼体重于胸鳍基部注射0.4?0.6yg/g的秋水仙素；取头肾细胞，使用0.075M KCl低渗35?45min，卡诺氏固定液固定2?4次，滴片前将卡诺氏固定液换成甲醇/乙酸混合液;在玻片表面呵一层水汽，距玻片I cm处滴加细胞悬浮液，置于空气中自然干燥；
(2)人类基因组DNA提取
用组织基因组DNA提取试剂盒提取人类唾液DNA，在刷牙前，将生理盐水倒入口中，漱口25?35s，吐到废液收集杯，再次将生理盐水倒入口中，用力漱口 Imin，然后仔细将漱口液吐入一次性口杯中，取1.5ml，室温离心12?18 min，离心速度为8000rmp，倒掉上清液，剩余口腔上皮细胞沉淀；
(3)探针制备
根据人类的 18S rDNA序列设计引物:18S-UF-5’- GGCACGAGACCGATAGTCAACA-3' 18S-UR-5’-ACCTGCTGCGGATATGGGTAC-3’；
PCR扩增反应体系为20μ?:10μΜ的引物各lyL，人类基因组DNA 0.9?1.lyL，10 Xbuffer 1.8?2.2yL，2.5mmol/L dNTP混合物I.5?I.7yL，2.5U/yL Fastful DNA聚合酶0.18?0.22yL，加双蒸水至20yL ；
使用缺口平移试剂盒标记探针，反应体系为20yL: 10 X buffer 1.8?2.2yL，试剂盒中的酶混合液2.8?3.2yL，dNTP 6.8?7.2yL，B1tin_dUTP 0.28?0.32yL，人类 18S rDNA扩增产物0.9?I.lyg，加蒸馏水至20yL，14.5?15.5°C反应85?95min，取I.90?2.1yL缺P平移产物用于1%的琼脂糖凝胶电泳分析；
剩下的18yL探针溶液用4.5?5.5yL 3M醋酸钠、9.5?10.5yL鲑精DNA、98?102yL无水乙醇进行沉淀，54.5?55.5°C开盖干燥后溶于38?42yL杂交缓冲液中，制成探针混合液；
(4)荧光原位杂交(FISH)
①标本的预处理:将玻片进行老化、蛋白酶K、丙酮处理，然后放入体积分数为78?82%的甲酰胺/2 X SSC溶液中，64.5?65.5°C变性2.4?2.6min，并用冰乙醇脱水处理；
②探针变性:将探针混合液在74?76°C的水浴锅中变性7?9min，然后迅速转入冰中迅速冷却1min以上；
③杂交:滴20yL变性的探针混合液于大黄鱼染色体玻片上，盖封口膜，置于湿润暗盒中，36.5?37.5°(3孵化12?1611;
④杂交后洗脱:将杂交后的玻片依次用体积分数为9?11%的甲酰胺/2X SSC和4 X SSC洗涤;其次，用Avidin-Alexa Fluor 488溶液与探针分子在36?38°C、湿润黑暗的环境中特异结合28?32min，依次使用4 X SSC-Trixton和4 X SSC洗涤;端粒重复序列FISH定位需要经过第二次特异结合，即在玻片上滴加B1tinylated Ant1-Avidin D溶液培育30min后洗脱，再滴加Avidin- Alexa Fluor 488溶液培育30min后再洗脱;最后，在玻片上滴加PI抗褪色剂复染，荧光显微镜观察结果；
⑤信号检测:使用OlympusBX53荧光显微镜完成显微观察与拍照，通过绿色荧光滤片组观察红色荧光信号，通过蓝色荧光滤片组观察绿色荧光信号，利用显微镜相连的DP73电荷藕合器件图像传感器(CCD)拍摄图像，使用cellSens软件分别采用黑白模式采集图像，再组合通道形成彩色图像。
[0006]作为本发明进一步的方案:所述步骤(I)中，甲醇/乙酸的混合液中，甲醇:乙酸的体积比为1.8?2.2:1。
[0007]作为本发明再进一步的方案:所述步骤(3)中，PCR扩增反应的条件为:97.5?98.5°C预变性4?6min;97.5?98.5°C变性28?328，58?62°(3退火28?328，71?73°(3延伸3?5min，循环35次;最后71?73°C延伸9?11111；[11，3?5°(^保存。
[0008]与现有技术相比，本发明的有益效果是:
该分子标记是从人类唾液中克隆的一段28S rDNA序列，然后制备成探针，与大黄鱼中期染色体杂交，从而获得阳性信号。该探针对大黄鱼染色体作FISH时，可在每条中期染色体的着丝粒及短臂区域上检测到阳性信号，同一条染色体上短臂的信号强度弱于着丝粒信号强度，不同染色体间着丝粒信号强度也存在差异。该发明可以阳性信号可以作为染色体识别和配对的标记;也可以显示出大黄鱼染色体组的差异，用于辅助分析这两个物种杂交后代的染色体组成。
【附图说明】
[0009]图1为H-P3K在大黄鱼雌性(I)、大黄鱼雄性(2)染色体上的定位。
[0010]图中:(1，2)小框列出非端部着丝粒染色体，标尺=5μπι。
【具体实施方式】
[0011]下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
[0012](I)染色体制备
提前20h按每克鱼体重于胸鳍基部注射8 mg党参的煎汁液/20yg BSA混合液，暂养于25°C海水中；提前5h再用同样方法注射同样的试剂；提前2.5h按每克鱼体重于胸鳍基部注射0.5yg/g的秋水仙素;取头肾细胞，使用0.075M KCl低渗40min，卡诺氏固定液固定3次;滴片前将卡诺氏固定液换成体积比为甲醇/乙酸=2:1的混合液;在玻片表面呵一层水汽，据玻片Icm处滴加细胞悬浮液，置于空气中自然干燥；
(2)人类基因组DNA提取
用组织基因组DNA提取试剂盒(上海捷瑞)提取人类唾液DNA;在早饭刷牙前，将生理盐水倒入口中，漱口 30s，吐到废液收集杯，再次将生理盐水倒入口中，用力漱口 Imin，然后仔细将漱口液吐入一次性口杯，取1.5ml，室温离心15 min，离心转速为8000rmp，倒掉上清液，剩余口腔上皮细胞沉淀，然后具体步骤参照试剂盒的操作步骤；
(3)探针制备
根据人类的 18S rDNA序列设计引物:18S-UF-5’- GGCACGAGACCGATAGTCAACA-3 ’ 18S-UR-5’-ACCTGCTGCGGATATGGGTAC-3’；
扩增反应体系为20μ?:10μΜ的引物各lyL，人类基因组DNA IyL，10 Xbuffer 2yL，2.5mmol/L dNTP混合物1.6yL，2.5UAiL Fastful DNA聚合酶 0.241^，加双蒸水至2(^1^
PCR扩增反应条件为:98°C预变性5min ； 98°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸4min，循环35次;最后72°C延伸1min，4°C保存；
使用缺口平移试剂盒(Roche)标记探针，反应体系为20yL:1OXbuffer 2yL，试剂盒中的酶混合液3yL，dNTP 7yL，B1tin-dUTP 0.3yL，人类18S rDNA扩增产物Iyg，加蒸馏水至20UL，15°C反应90min，取2yL 口平移产物用于1%的琼脂糖凝胶电泳分析；
剩下的18yL探针溶液用5yL 3M醋酸钠，1yL鲑精DNA，10yL无水乙醇沉淀，55°C开盖干燥后溶于40yL杂交缓冲液中，制成探针混合液；
(4)荧光原位杂交(FISH) ①标本的预处理
将玻片进行老化、蛋白酶K、丙酮处理，然后放入体积分数为80%的甲酰胺/2 X SSC溶液中，65°C变性2.5min，并迅速用系列冰乙醇脱水；
②探针变性
将探针混合液在75°C的水浴锅中变性8min，然后迅速转入冰中迅速冷却1min以上；
③杂交
滴20yL变性的探针混合液于大黄鱼染色体玻片上，盖封口膜，置于湿润暗盒中，37°C孵化过夜，孵化时间控制在12-16h;
④杂交后洗脱
将杂交后的玻片依次用体积分数为10%的甲酰胺/2 X SSC和4 X SSC洗涤；其次，用Avidin- Alexa Fluor 488溶液与探针分子在37°C、湿润的、黑暗的环境中特异结合30min，依次使用4 X SSC-Trixton和4 X SSC洗涤;端粒重复序列FISH定位需要经过第二次特异结合，即在玻片上滴加B1tinylated Ant1-Avidin D溶液培育30min后洗脱，再滴加Avidin-Alexa Fluor 488溶液培育30min后再洗脱;最后，在玻片上滴加PI抗褪色剂复染，荧光显微镜观察结果；
⑤信号检测
使用Olympus BX53荧光显微镜完成显微观察与拍照，通过绿色荧光滤片组(GW)观察红色荧光信号，通过蓝色荧光滤片组(BW)观察绿色荧光信号，利用显微镜相连的DP73电荷藕合器件图像传感器(CCD)拍摄图像，使用cellSens软件分别采用黑白模式采集图像，再组合通道形成彩色图像。
[0013]说明书核苷酸序列表 DNA 22
显示大黄鱼着丝粒和短臂的方法的上游引物Fl GGCACGAGACCGATAGTCAACA DNA 21
显示大黄鱼着丝粒和