诊断败血症或败血症风险的方法

诊断败血症或败血症风险的方法
【专利说明】
[0001] 本申请要求2013年8月7日提交的美国临时专利申请序列No.61/863,266的权益， 所述申请的公开内容整体W引用方式并入本文。
[0002] 本发明根据化087088、化018208和化094797(每个由美国国立卫生研究院授予)在 政府支持下进行。政府具有本发明的某些权利。
技术领域
[0003] 公开了诊断败血症或败血症风险的方法，W及治疗患者的败血症的方法。还公开 了辨别败血症和全身炎性反应综合症(SIRS)的方法，W及治疗患者的SIRS的方法。
[0004] 背景
[000引严重败血症，一种对与急性器官功能障碍相关的感染的全身炎性反应，是儿童和 成人中发病率和死亡率的日益增加的原因，并且已成为影响750,000个个体/年的重症护理 中最重大挑战之一，其中死亡率为大约30%(Rittirsch等，"Harmful Molecular Mechanisms in Sepsis/'Nat.Rev.Immunol.8:776-787(2008);Angus等，"Epidemiology of Severe Sepsis in the United States：Analysis of Incidence,Outcome,and Associated Costs of Care/'Crit.Care Med.29:1303-1310(2001))。促炎性信号在败血 症的早期阶段出现，并且允许循环中性粒细胞进入炎症部位并吞隧外来病原体和坏死/调 亡细胞。蛋白水解酶，诸如弹性蛋白酶和和髓超氧化物酶(MP0)存储在中性粒细胞内的嗜苯 胺蓝顆粒中，并响应于被感染部位的多种机械、热和化学刺激而释放。中性粒细胞还产生活 性氧物质诸如过氧化氨、超氧化物和一氧化氮(化than,C.，"Neu化ophiIs and Immunity: Qiallenges and 0卵ortunities /'Nat .Rev. Immunol .6:173-182(2006))。虽然运些炎性介 质对于宿主防御是重要的，但它们也参与内皮和血管外宿主组织损伤（Nathan，C.， "Neutrophils and Immunity ：Challenges and Opportunities，''Nat.Rev. Immunol.6: 173-182(2006))。因此，在不受控制的炎性病症诸如败血症中，在此期间，许多中性粒细胞 在内皮界面和在下面的组织中变得具有活性，过盛的炎性活性导致进一步的微血管功能障 碍和组织损伤（Brown等，"Neutrophils in Development of Multiple Organ Failure in Sepsis/'Lancet 368:157-169(2006))。许多报道已记录极度活跃的中性粒细胞在内脏器 官的微脉管系统中隔离是多器官衰竭的主要促成因素，此为败血症的重要特点（Brown等， "Neutrophils in Development of Multiple Organ Failure in Sepsis/'Lancet 368： 157-169(2006);Suda等，"Neutrophil Elastase Inhibitor Improves SurviVal of Rats With Clinically Relevant Sepsis/'Shock 33:526-531(2010);Kovach等，"The F^mction of Neuhophils in Sepsis,"Curr.Opin.Infect.Dis.25(3):321-7(2012))0因 此，中性粒细胞募集可作为败血症中的双刃剑。
[0006]治疗介入要求全身炎性病症过程中白细胞转运步骤的机械知识。还需要用于诊断 败血症，辨别败血症和全身炎性反应综合症和治疗败血症的精确方法。本申请针对克服本 领域的运些和其它不足。
[0007] 概要
[0008] -方面设及诊断受试者中的败血症或败血症风险的方法。该方法包括检测受试者 中具有升高的整合素 VLA-3(CD49c/CD29)表达水平的中性粒细胞亚群的存在，借此中性粒 细胞亚群的存在表明受试者患有败血症或具有败血症风险。
[0009] 第二方面设及诊断受试者中的败血症或败血症风险的方法。该方法包括使来自受 试者的生物样本与特异性结合至生物样本中的整合素 VLA-3(CD49c/CD29)的试剂接触;检 巧肉生物样本中的整合素 VLA-3结合的试剂；W及测定生物样本中整合素 VLA-3的表达水 平，其中相对于整合素 VLA-3的对照水平，生物样本中升高水平的整合素 VLA-3表明受试者 患有败血症或处于发展败血症的风险。
[0010] 第Ξ方面设及辨别败血症和全身炎性反应综合症(SIRS)的方法。该方法包括检测 患有全身炎症的受试者中具有升高的整合素 VLA-3表达水平的中性粒细胞亚群的存在或不 存在，借此中性粒细胞亚群的存在表明受试者患有败血症，而中性粒细胞亚群的不存在表 明受试者患有SIRS。
[0011] 第四方面设及辨别败血症和全身炎性反应综合症(SIRS)的方法。该方法包括使来 自受试者的生物样本与特异性结合至生物样本中的整合素化A-3(CD49c/CD29)的试剂接 触;检测与生物样本中的整合素 VLA-3结合的试剂；W及测定生物样本中整合素化A-3的表 达水平，其中相对于整合素 VLA-3的对照水平，升高水平的整合素 VLA-3表明受试者患有败 血症，而相对于整合素化A-3的对照水平，没有升高水平的整合素化A-3表明受试者患有 SIRS。
[0012] 中性粒细胞向感染部位的迁移对于病原体清除W及因此宿主存活至关重要。细胞 表面整合素与其对应物配体的相互作用导致循环中性粒细胞粘附并定向迁移至感染部位。 因此，整合素的重要作用是使活性中性粒细胞在感染位点聚集，从而确保它们的免疫产物 和活性在该部位保持。然而，败血症期间过度的整合素活性导致大量中性粒细胞浸润到非 感染组织和伴随相关组织损伤的扩大的炎性反应。
[0013] 随附的实施例显示，不同于其它细胞外基质结合整合素，整合素化A-3(CD49c^ CD29)在从人败血症患者和小鼠败血症模型分离的中性粒细胞亚群上显著上调。与Grl胃 CDUb%LA-#粒细胞群相比，来自败血症动物的Grl胃CDUb%LA-3胃细胞显示高炎性表型。 施用VLA-3括抗剂肤和粒细胞中VLA-3表达的条件性消耗显著减少外渗中性粒细胞的数目 并改善败血症小鼠的存活。因此，在随附实施例中提供的结果显示VLA-3是败血症中组织归 巢和高反应性中性粒细胞亚型的独特标志^并且阻断VLA-3代表通过选择性祀向高炎性、快 速组织浸润性中性粒细胞亚型(Grl胃CDUb%LA-3胃)而用于治疗败血症的新治疗方法。通过 使用多光子活体显微镜检查(MP-IVM)，显示通过施用VLA-3括抗剂肤显著减少中性粒细胞 的外渗。因此，经由VLA-3选择性祀向活性、高炎性、快速组织浸润性中性粒细胞亚型(Gr 1胃 CDUb%LA-3胃)会在败血症期间将器官衰竭减至最低。未接触初始细胞，从而避开医源性免 疫抑制，运是在其它抗炎疗法中遇到的主要问题。
[0014] 附图简述
[001引图1A-1C证明整合素 VLA-3在败血症中人中性粒细胞上上调。在图1A中，分离来自 严重非感染性SIRS患者(n = 8,年龄63.5±8.9,病症:C0PD、肺纤维化、呼吸窘迫、鱗状细胞 癌、APCAHE II评分:21±6)、严重败血症患者(n = 6,年龄53.5±15,感染源:肾脏、肺、腹部、 泌尿生殖系统，阳性血液培养:83%，APCAHE II评分:33± 12)和健康供体(η = 5，年龄41 ± 14)的中性粒细胞，并且通过流式细胞术测量整合素的表面表达。结果表示为整合素表达平 均巧光强度(MFI)与相同供体的同种型对照MFI的比率。*p<0.05。图1B显示描绘诊断后在 不同时间点VLA-3表达的强度的直方图。该图代表六名败血症患者中的一名。图1C显示分离 自健康供体的中性粒细胞用PMA( 20ng/ml)、TNF-a (20ng/ml)、LPS(100μg/ml)或fMLP(ΙμΜ) 刺激1小时或3小时。通过RT-PCR测定与未刺激细胞相比VLA-3的基因表达的倍数变化（上 图），并且通过流式细胞术测量其表面表达(下图）。结果表示3个单独供体的平均值±SEM。* p<0.050
[0016] 图2显示整合素 VLA-3在鼠败血症中上调。通过流式细胞术测量败血症小鼠中性粒 细胞上的整合素表达。在所指示的时间点，细胞分离自初始和败血症小鼠的骨髓(BM)、腹腔 灌洗液(PL)和外周血。对于MFI分析，在Grl胃粒细胞上对细胞进行设口。结果表示为相对于 初始对照的MFI的倍数增加(初始血液MFI用于计算PL表达的％变化）。结果代表四只单独动 物/时间点的平均值±561^ ^ ^
[00Π ] 图3A-3C显示Grl胃CD1化胃VLA-3胃中性粒细胞的表型。在图3A中，伪彩色图显示在分 离自健康供体、SIRS和败血症患者的中性粒细胞中VLA-3胃和VLA-#群体的存在。在图3B中， 细胞分离自化化PS施用后12小时)并用CD1化和Grl抗体染色。将细胞分选为Grl胃和Grl吗立 细胞并在细胞离屯、涂片（cytospin)后用H&E染色。Grl?细胞显示具有环状或多叶核的中性 粒细胞形态，而Grl?细胞具有单核细胞样外观。伪彩色图显示在败血症小鼠的骨髓中Grl胃 CDUb胃成熟中性粒细胞中VLA-3胃和VLA-#群体的存在。在图3C中，在败血症后12小时和24 小时分离来自初始和化P诱导的败血症小鼠的BM细胞，并在Grl胃CD1化胃粒细胞上设口后分 选为VLA-3胃和VLA-3%田胞(上图）。下图显示确认BM中中性粒细胞中VLA-3胃和VLA-3%田胞的 存在。将细胞针对日3&(PE)和Ly6G(APC)或Grl(FITC)进行染色。流式细胞术图显示〇3&胃和口3 姑5粒细胞群体的存在。^ ^ ^
[001引图4A-4B显示Grl胃CDUb%LA-3胃中性粒细胞具有促炎性表型。在图4A中，如图3C所 描述对细胞进行分选，并且通过RT-PCR定量IL-6、TNF-a和IL-Ιβ基因表达的差异。柱状图显 示与初始细胞相比的?音数变化。在图4B中，使用生物发光测定来测量分离自化P和内毒素血 症小鼠的ΒΜ的VLA-3胃和VLA-#细胞的髓过氧化物酶(ΜΡ0)活性。将分选的细胞(5χ104个细 胞/孔）用ΡΜΑ(ΙμΜ)在鲁米诺（luminolKlmg/孔）的存在下进行刺激，并且对发光强度进行 成像。线形图化侧)显示VLA-3胃和VLA-3%田胞中MP0活性的动力学，并且示出各自的发光图 像。
[0019]图5A-5的兑明阻断VLA-3改善存活。在图5A和5B中，细胞分离自用对照肤(8祉g/剂， 静脉内）或LXY2(8祉g/剂，静脉内）注射的败血症小鼠（CLP后8小时）的化和肺。LXY2是环状 肤CysD-AspD-Gl}f-Ty;r(3-N〇2)-Gly-4Hyp-Asn-切SD(Yao等，"Discovery of Targeting Ligands for Breast Cancer Cells Using the One-Bead One-Compound Combinatorial Method/'J. Med.化em. 52(1) :126-133(2009)，其公开内容整体W引用方式并入本文）。抗 Ly6G(或抗Gr-1)和抗CDUb抗体用于对中性粒细胞进行染色。柱状图显示化和肺中中性粒 细胞的总数目（n = 5)。在图5C中，柱状图显示在8小时时内毒素血症动物的化中中性粒细胞 的总数目。在图5D中，为测定Ξ组小鼠的化中的细菌负载，将稀释的样本在TSA血琼脂上划 线，并在37°C下解育24小时后对菌落进行计数(n = 5)。进行化P手术和内毒素血症，并且使 用Kaplan-Meyer log-rank检验分析存活W比较对照（n = 9)与LXY2(n = 9)处理的小鼠。在 图祀中，通过夹屯、ELISA测量化-6的血清水平。该图显示比-6的浓度。*p<0.05。在图5F和5G 中，在静脉内注射对照肤或LXY2(8祉g)后，通过多光子活体显微镜检查(MP-IVM)评估LysM- GFP小鼠的f MLP诱注的睾提肌血管中LXY2对中性粒细胞体内迁移的作用。在图5H中，施用 LXY2的小鼠的fMLP诱注的睾提肌微脉管系统的透射电子显微镜成像。缩写:P = PMN，L =管 腔，Peri =周皮细胞，Endo=内皮细胞。图5A、5B和5E中的结果表示为平均值±561。*口< 0.05。
[0020]图6A-6I显示条件性消耗VLA-3改善存活。在图6A中，通过使表达弹性蛋白酶化la) 启动子中的Cre的小鼠与具有floxed整合素基因的小鼠杂交来实现VLA-3(a3-cK0)和αν(αν- cKO)的条件性消耗(参见方法）。对得自使Ela-Cre和as/avflox小鼠繁殖的幼盧针对杂合基 因表达进行基因分型研究，并且显示flox和突变ere二者均存在的小鼠用于进一步繁殖。通 过突变条带(吐6;18569，日3;42769具有？1/?3，日,;15069)的存在证实整合素基因的缺失。在 图6B中，在分离自LPS注射的WT或cKO小鼠的BM和化的细胞中测量Gr 1胃CDUb胃中性粒细胞中 口3和αν的表面表达。在图6C中，细胞分离自败血症cKO小鼠（CLP后6小时）的化和肺，并且抗 LyGG/Grl和抗CDUb抗体用于对中性粒细胞进行染色。柱状图显示化和肺中中性粒细胞的 总数目（η = 6)。在图6D中，细胞分离自败血症cKO动物（6小时）的I市，并且用Ly6G/Gr 1和 CD1化抗体进行染色W用于流式细胞术。该图显示肺中Ly6G胃CDUb胃细胞的频率。在图6E中， 示出化P后6小时cKO小鼠 （n = 6/组）的化中的细菌负载。在图6F中，使用Kaplan-M巧er log- rank检验分析存活W比较cKO和Ela-化e对照小鼠 η = 12/组。在图6G中，示出如通过化ISA测 量的IL-6的血清水平。该图显示IL-6的浓度（η = 6/组）。在图6H和61中，通过MP-1VM评估 fMLP诱注的睾提肌血管中VLA-3对中性粒细胞体内迁移的影响。Ela-Cre小鼠用作a3-cK0的 对照。对于图抓、6E和6F，结果表示为平均值± SEM。*p < 0.05。
[0021 ] 详述
[0022] 本文描述的第一方面设及诊断受试者中的败血症或败血症风险的方法。对于运方 面和其它方面的目的，目标"受试者"涵盖动物，包括任何哺乳动物，尤其是人。在诊断受试 者中的败血症或败血症感染风险的情形中，目标受试者涵盖处于接触败血症感染的风险的 任何受试者。尤其易受影响的受试者包括婴儿和少年，W及免疫功能不全的少年和成人W 及老年人。然而，处于败血症感染的风险的任何婴儿、少年、成人或老年人或免疫功能不全 的个体可根据本文所述的方法进行诊断。
[0023] 根据一种方法，所述方法包括检测受试者中具有升高的整合素化A-3(CD49c/ CD29)表达水平的中性粒细胞亚群的存在，借此中性粒细胞亚群的存在表明受试者患有败 血症或具有败血症风险。
[0024] 根据另一种方法，所述方法包括使来自受试者的生物样本与特异性结合生物样本 中的整合素 VLA-3的试剂接触;检测与生物样本中的整合素 VLA-3结合的试剂，并测定生物 样本中整合素 VLA-3的表达水平，其中相对于整合素 VLA-3的对照水平，生物样本中升高水 平的整合素 VLA-3表明受试者患有败血症或处于发展败血症的风险。
[0025] 如本文所用，术语"样本"是获自受试者的生物样本。该生物样本可为含有中性粒 细胞的任何样本。本领域技术人员将认识到可使用血浆、全血或全血的亚级分。生物样本还 可为血清或骨髓。可使用标准程序获得运些各种生物样本W用于回收特定样本。
[0026] 例如，可通过使用标准抽血获得血液或血清样本，如WhUe的美国专利No. 4，263， 922所公开，所述专利的公开内容整体W引用方式并入本文。通常，在标准抽血中，通过针组 件和把手系统将血液抽取到收集管中。抽血之后，将针组件和把手从管末端移除，并且单独 的盖合适地盖在管的每个末端W将血液样本保持在管中W供分析。在人的情况中，用采血 针(lancet)刺破指尖取血或通过标准静脉穿刺进行抽血也是获得体液样本的便利方法。可 使抽取的血液立即暴露于抗凝剂W阻止其凝固。已知的抗凝剂包括但不限于肝素、邸TA、D- Phe-Pro-A巧氯甲基酬二盐酸盐ΓΡΡΑΟΤ'）和巧樣酸钢。
[0027] 可根据本领域已知的程序获得骨髓样本。例如，可使用针吸或其它已知技术获得 骨髓样本。在某些实例中，可使用Ficoll-Hypaq密度梯度从骨髓样本中分离细胞。用于获得 骨髓样本的其它程序包括骨活检装置，诸如中空套管或针。不管用于获取样本的工具是什 么，然后可制备骨髓样本W供随后分析(例如，固定和标记）。可根据Silva等的美国专利公 开No.2014/0038177中所描述的方法获得样本，所述专利公开的公开内容整体W引用方式 并入本文。
[0028] 根据另一个实施方案，样本可通过腹腔灌洗获得。简言之，诊断性腹腔灌洗(D化） 是将有孔的透析导管引入腹腔中W获得流体用于实验室分析。D化通过至少Ξ种不同的技 术来实施，所述技术采用略微不同的设备和方法。在所有技术中，通过放置膀脫导管和胃管 用于对膀脫和胃降压来准备患者。在一种技术（即，不公开的技术）中，通过使用尖锐的套管 针制作小皮肤切口来放置透析导管。运项技术已得到改进W降低对腹部内脏的风险。该改 进的技术使用Seldinger导丝，其被称为"导丝穿针(wire through needle)"方法。通过18 号短斜面引导针将J形尖端的弹黃导丝传入骨盆。取出针并且多孔腹腔灌洗导管沿着导丝 前行至骨盆。移除J导丝，然后使用确定的技术对腹腔液进行取样。
[0029] 炎症可分类为急性或慢性。急性炎症是身体对有害刺激的最初反应，并且通过激 活免疫细胞随后释放各种介质和增加白细胞从血液向受损组织移动来达到。持续炎症，称 为慢性炎症，导致存在于炎症部位的细胞的类型的渐进转变，并且特征在于组织从炎性过 程同时破坏和痊愈。败血症是严重的医学病症，其特征在于全身炎性状态(称为全身炎性反 应综合症或SIRS)并且存在已知或疑似感染。身体可针对血液、尿、肺、皮肤或其它组织中的 微生物发展运种炎性反应。细菌入侵其它无菌部位像腹腔导致立即开始炎性反应。对运种 反应必须的是氧自由基，其主要被产生来杀灭微生物，但也可通过膜憐脂的过氧化反应损 害宿主结构（Hampton 等，"Inside the Neutrophil Pha邑ο s ome : Ox i dan t s， Meyloperoxidase'and Bacterial Killing/'Blood 92:3007-3017(1998) ;Meie;r的WO 2013/104798,所述文献的公开内容整体W引用方式并入本文）。
[0030] 败血症或败血症风险的诊断可用于由感染生物体的类型表征的Ξ种主要类型的 败血症。革兰氏阴性败血症是最常见的并且病死率为约35%。运些感染的大多数由大肠杆 菌化scherichia coli)、克雷伯氏肺炎菌化lebsiella pneumonie)和铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa)引起。革兰氏阳