植物糖原纳米颗粒及其制造方法
【专利说明】
[0001] 相关申请的引证
[0002] 本申请要求2013年4月26日提交的美国专利申请61/816686的优先权，并且其内容 由此W其整体并入。
技术领域
[0003] 本发明设及植物糖原(phytoglycogen)纳米颗粒W及生产植物糖原纳米颗粒的方 法。
【背景技术】
[0004] 植物糖原和糖原是由1,4-葡聚糖链组成的葡萄糖多糖，其通过α-1,6-葡萄糖巧键 高度支化，其在植物动物细胞中发挥储能介质的作用。糖原W直径为20-200nm的致密颗粒 的形式存在于动物组织中。糖原也发现积累在微生物中，例如细菌和酵母菌。植物糖原是一 种在结构和物理性质上与糖原相似的多糖，并且起源于植物。
[0005] 糖原和植物糖原被认为是"高度分散的"或非均质材料。对于已知的制剂，糖原典 型地具有处于1〇6和1〇8道尔顿之间的分子量，具有相应的大的多分散性。动物和植物组织W 及提取的糖原/植物糖原制剂的透射电子显微镜(TEM)观察已经掲示了运些多糖的微粒性 质。常报道的糖原或植物糖原的颗粒直径处于20-300nm的范围内并且具有连续或多峰 (multimodal)尺寸分布。20-30nm的小颗粒被称为β-颗粒，而100-300nm的大颗粒被称为α- 颗粒。认为，α-颗粒是由β-颗粒聚集(aggregation)或群聚（clustering)组成的[1]。
[0006] 已经开发了各种方法从活有机体中分离糖原和植物糖原，最常见的是为了量化生 物样品中积累的总糖原的量，并且偶尔为了将糖原在应用中用作产品。
[0007] 最常用的方法是从动物组织、特别是从海洋动物、尤其是软体动物提取，因为它们 有能力积聚糖原。例如，美国专利5,734,045公开了通过使用热碱提取、随后使用阳离子树 脂中和并处理所产生的溶液从蛛类制备不含蛋白质的糖原的方法。例如，在专利申请W0/ 1997/021828所描述的，糖原也可W通过酵母菌发酵来生产。美国专利7，670,812描述了一 种通过使酶的混合物与低分子量糊精接触生物合成生产糖原样多糖的方法。甜玉米和香稻 可作为糖原的来源;参见例如专利申请EP0860448B1，其描述了从香稻粒分离糖原的方法。 [000引糖原/植物糖原分离的主要步骤通常包括:通过粉碎/研磨/娠磨等破碎生物质;将 糖原提取到水相中；通过过滤和/或离屯、分离不溶性固体颗粒；消除微细分散或溶解的脂 质、蛋白质和低分子量污染物;和浓缩并干燥。
[0009] 为了提高第二提取步骤中糖原的收率，通常在提高的溫度下和/或使用碱性溶液 或酸性溶液进行提取。此种工艺包括使用热的浓(20-40 % )碱溶液[2，3 ]、冷酸[4]或沸水 [引对研细的生物材料进行初始处理。
[0010] 在糖原分离/纯化的常规方法中使用的工序导致糖原结构的大量水解、低分子量 产物的显著增加和分子的化学改变。
[0011] 已经开发了各种较溫和的提取工序，诸如冷水提取[6]，并且得到的产物据称接近 天然状态的糖原的表现度。但是，已知由冷水提取法生产的糖原制剂是高度多分散的[7， 1]〇
[0012] 已知有多种方法用于进行从精细分散的蛋白质、脂质、核酸和其他多糖中纯化粗 制糖原提取物的步骤。可W通过使用脱氧胆酸盐(D0C)、S氯乙酸(TCA)、多价阳离子和/或 酶处理(蛋白酶、核酸酶）的选择性沉淀来除去蛋白质和核酸。还已经使用通过将蛋白质盐 析出来(例如使用硫酸锭)或通过离子交换W去除蛋白质的方法。蛋白质去除的另一种常用 方法是热凝固，通常在65-100°C，随后离屯、或过滤。高压灭菌法（121°C，latm)也已经被用来 凝固蛋植物糖原提取物中的蛋白质[引。另外，可W使用酪水提取法除去蛋白质和脂质。
[0013] 国际专利申请公开号W0 2013/019977(化0)教导了一种获得包括植物糖原的提取 物的方法，其包括超滤，但是也使水性提取物经受酶处理，运同时降解了植物糖原及其他多 糖。Yao提取了一种降低植物糖原粘度的方法，其通过使植物糖原经受β-淀粉分解，即使用 β-淀粉酶进行酶促水解。通过化0的方法产出的"经纯化的植物糖原"不仅包括植物糖原，而 且包括植物原的衍生物，衍生物包括β-糊精和其他多糖的消化产物。化0的方法进一步包括 将提取物加热至l〇〇°C (参见化〇的实施例1)。
[0014] 美国专利5,895,686公开了一种用于通过水或含水溶液(在室溫下)从水稻提取植 物糖原的方法，并且通过热变性和TCA沉淀除去蛋白质。产物具有多峰分子量分布，相应地 具有高多分散性和大水溶液粘度。运些性质可归因于来自植物材料的糖原制剂中大量支链 淀粉和直链淀粉的存在，还归因于糖原提取过程中糖原的降解。
[0015] 美国专利5，597，913和5，734，045描述了产生基本不含含氮化合物和还原糖的糖 原的工序，指示了其不含蛋白质和核酸的纯度。运些专利教导了选定组织在高pH溶液中沸 腾的使用。
[0016] 转让给本发明的拥有人的美国专利申请公开号US20100272639 A1提供了一种用 于从细菌和贝类生物质中分离糖原的方法。细菌被教导为是优选的，因为可W进行方法W 获得不具有其他大分子量多糖(诸如支链淀粉和直链淀粉)并且不含与贝类或动物组织有 关的致病细菌、寄生虫、病毒和航病毒的生物质。所公开的方法大体包括步骤:通过法式按 压（French pressing)或通过化学处理进行细胞瓦解（disintegration);通过离屯、分离不 溶性细胞组分;通过酶处理、随后渗析从细胞裂解物中除去蛋白质和核酸，其产生含有粗制 多糖和脂多糖(LPS)的提取物或，可替代地，酪-水提取;通过弱酸水解或通过多价阳离子的 盐的处理(其引起不溶性LPS产物的沉淀)消除LPS;和通过超滤和/或尺寸排阻色谱法纯化 富集了糖原的级分;和使用适合的有机溶剂沉淀糖原或可W通过超滤或超速离屯、法获得浓 缩的糖原溶液;和冷冻干燥W产生糖原的粉末。从细菌生物质分离出的糖原的特点是MWt 5.3-12.7x 106Da，具有直径为35-40nm的颗粒尺寸并且是单分散性的(PDI =Mn/Mw= 1.007- 1.03)。
【发明内容】
[0017] 在一个实施方式中，描述了一种从含有植物糖原的植物材料中获得植物糖原纳米 颗粒的组合物，通过动态光散射(DLS)测定，该植物糖原纳米颗粒具有小于0.3的多分散指 数。在一个实施方式中，通过化S测量，植物糖原纳米颗粒具有小于0.2的多分散指数。在一 个实施方式中，通过化S测量，植物糖原纳米颗粒具有小于0.1的多分散指数。
[001引在一个实施方式中，植物糖原纳米颗粒具有约30nm至约150nm之间的平均颗粒直 径。在一个实施方式中，植物糖原纳米颗粒具有约60nm至llOnm之间的平均颗粒直径。
[0019] 在一个实施方式中，组合物基于干重包括多于80%的植物糖原纳米颗粒，该植物 糖原纳米颗粒具有约30nm至150nm之间的平均颗粒直径。在一个实施方式中，组合物基于干 重包括多于90 %的植物糖原纳米颗粒，该植物糖原纳米颗粒具有约30nm至15化m之间的平 均颗粒直径。在一个实施方式中，组合物基于干重包括多于99 %的植物糖原纳米颗粒，该植 物糖原纳米颗粒具有约30nm至150nm之间的平均颗粒直径。在一个实施方式中，组合物基于 干重包括多于80 %的植物糖原纳米颗粒，该植物糖原纳米颗粒具有约60nm至llOnm之间的 平均颗粒直径。在一个实施方式中，组合物基于干重包括多于90%的植物糖原纳米颗粒，该 植物糖原纳米颗粒具有约60nm至llOnm之间的平均颗粒直径。在一个实施方式中，组合物基 于干重包括多于99 %的植物糖原纳米颗粒，该植物糖原纳米颗粒具有约60nm至llOnm之间 的平均颗粒直径。
[0020] 在一个实施方式中，含有植物糖原的植物材料获自玉米、水稻、大麦、高梁或它们 的组合。在一个实施方式中，含有植物糖原的植物材料是标准型（SU)或含糖增量剂 (surgary extender,se)型甜玉米。在一个实施方式中，含有植物糖原的植物材料获自乳熟 期或凹陷期玉米粒。
[0021] 在一个实施方式中，组合物是粉末。在另一个实施方式中，组合物是植物糖原纳米 颗粒的含水分散体。
[0022] 本文还描述了一种生产单分散性植物糖原纳米颗粒的方法，包括:a.将破碎的含 有植物糖原的植物材料沉浸在约0和约50°C之间的水中；b.使步骤(a.)的产物经受固液分 离W获得含水提取物;C.使步骤(b.)的含水提取物通过具有约0.05和0.15WI1之间的最大平 均孔径的微滤材料;和d.使来自步骤C.的滤出液经受超滤W除去具有低于约300W)a的分子 量的杂质，从而获得包含单分散性植物糖原纳米颗粒的含水组合物。
[0023] 在方法的一个实施方式中，含有植物糖原的植物材料是谷物。在一个实施方式中， 谷物是玉米、水稻、大麦、高梁或它们的混合物。在一个实施方式中，含有植物糖原的植物材 料是标准型（SU)或含糖增量剂（se)型甜玉米。在一个实施方式中，含有植物糖原的植物材 料是标准型(SU)或含糖增量剂(se)型甜玉米的乳熟期或凹陷期巧粒。
[0024] 在一个实施方式中，方法包括步骤(e.)使包含单分散性植物糖原纳米颗粒的含水 组合物经受使用淀粉薦糖酶、糖基转移酶、支化酶或它们的任何组合的酶处理。
[0025] 在一个实施方式中，方法包括步骤(e.l)干燥包含单分散性植物糖原纳米颗粒的 含水组合物，W获得基本上为单分散性植物糖原纳米颗粒的干燥的组合物。
[0026] 在一个实施方式中，方法包括在步骤C或步骤d之前添加吸附性过滤助剂。在一个 实施方式中，吸附性过滤助剂是娃藻±。