抑制肿瘤细胞增殖的多肽类似物和对应的编码cDNA及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及多肽类似物，特别涉及一种抑制肿瘤细胞增殖的多肽类似物和对应的 编码cDNA及应用。
【背景技术】
[0002] NS蛋白又称为鸟苷酸结合蛋白样3(guanine nucleotide binding protein-like 3，GNL3)，其在胚胎发生、组织再生和肿瘤的发生等过程中均扮演重要的角色，NS蛋白的这 些功能与其促进细胞周期进程的功能密不可分。NS蛋白的表达和肿瘤的恶性程度有密切的 关系，干扰NS蛋白的表达可引起这些肿瘤增殖能力的普遍下降。因此，NS蛋白已成为防治肿 瘤药物研制的重要靶点之一。
[0003] 近年来有研究表明，NS蛋白可通过与抑癌基因相互作用，抑制抑癌基因的功能，促 进肿瘤的发展。例如，NS蛋白与P53相互作用，使P53表达下调，可通过抑制P21基因的转录促 进细胞的过度增殖，也可通过影响Bcl-2蛋白家族的功能而抑制凋亡，诱导肿瘤的产生。
[0004] p27是重要的细胞周期G1周期蛋白抑制因子，其可以结合⑶K4-Cyclin D复合物， 抑制后者的活性和细胞周期G1-S期转换，从而抑制肿瘤细胞的增殖。本专利公布的数据表 明，肿瘤中，NS蛋白可与p27发生相互作用，促进肿瘤细胞中p27的降解。导致肿瘤细胞的过 度增殖和发展。因此，阻断NS蛋白与抑癌基因 p27的相互作用成为我们寻找抗肿瘤药物的新 策略。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种抑制肿瘤细胞增殖的多肽类似物及应用，至少能够解决 上述问题之一。
[0006] 为实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种抑制肿瘤细胞增殖的多肽 类似物，其氨基酸序列如序列表SEQ NO. 1所示：。抑制肿瘤细胞增殖的多肽类似物用于干扰 NS蛋白与p27相互作用。
[0007] 相应地，本发明还提供了上述抑制肿瘤细胞增殖的多肽类似物的应用，在制备抗 肿瘤药物的应用。
[0008] 相应地，本发明还提供了上述抑制肿瘤细胞增殖的多肽类似物的编码cDNA序列， 其序列如序列表SEQ NO. 1所示。
[0009] 相应地，本发明还提供了上述抑制肿瘤细胞增殖的多肽类似物的编码cDNA序列的 应用，在制备抗肿瘤药物的应用。
[0010]本发明的有益效果为:本发明基于肿瘤中核仁蛋白灿(31608七6111；[11(吧)与细胞周期 蛋白依赖性激酶抑制蛋白（CKI)成员p27kipl(简称P27)相互作用结构域的确立，利用基因 工程方法构建出了多肽类似物NS 118_288aa。本发明多肽类似物能够阻断NS蛋白和p27的相互 作用，抑制NS蛋白对p27降解，从而发挥抑制肿瘤细胞的过度增殖的功能。可为肿瘤治疗靶 点的探寻提供理论依据，对于应用于肿瘤的临床治疗具有十分重要的开发前景。
【附图说明】
[0011] 图1、图1A为p27和NS蛋白进行免疫沉淀的免疫沉淀复合物检测实验结果图，图1B 为免疫荧光分析NS蛋白和p27在肝癌细胞中的共定位情况；
[0012] 图2、图2上部为NS蛋白的不同截断片段，图2下部为免疫沉淀结果检测图；
[0013] 图3、步骤S102中重组真核表达载体图谱；
[0014]图4、步骤S102中HepG2细胞系中免疫印迹证明多肽的蛋白表达实验结果图；
[0015]图5、步骤S103中免疫印迹表明HepG2细胞系中多肽类似物阻断NS和p27的相互作 用实验结果图；
[0016]图6、步骤S104中免疫印迹表明HepG2细胞系中多肽类似物抑制NS对p27的降解实 验结果图；
[0017] 图7、步骤S201中流式细胞仪测定HEP3B细胞系中多肽类似物阻滞细胞周期进程实 验结果图；
[0018] 图8、步骤S202中转染以及未转染细胞细胞培养表明细胞系中多肽类似物抑制肿 瘤细胞增殖实验结果图。
[0019] 图9、步骤S203中未转染及稳定转染Flag-NS118~288aa表达质粒的HepG2细胞体内形 成肿瘤实验结果图。
【具体实施方式】
[0020] 下面结合附图对本发明作进一步详细的说明。
[0021] 本发明提供了一种抑制肿瘤细胞增殖的多肽类似物，其氨基酸序列如序列表SEQ NO. 1所示。抑制肿瘤细胞增殖的多肽类似物用于干扰NS蛋白与p27相互作用。上述抑制肿瘤 细胞增殖的多肽类似物可应用于制备抗肿瘤药物。
[0022] 相应地，本发明还提供了上述抑制肿瘤细胞增殖的多肽类似物的编码cDNA序列， 其序列如序列表SEQ N0.2所示。本发明还提供了上述抑制肿瘤细胞增殖的多肽类似物的编 码cDNA序列在制备抗肿瘤药物的应用。
[0023] 一、以下为NS蛋白与p27相互作用的验证。
[0024] (1) p27和NS蛋白在肝癌细胞中存在直接的相互作用及细胞内共定位。
[0025] 将肝癌组织进行组织以IP裂解液（50mM Tris-HCl pH8.0、150mM NaCl、l%NP-40、 5mM EDTA、20mM MgC12、lXRoche phosphatase&Protease inhibitor cocktail)裂解后， 分别以p27和NS蛋白进行免疫沉淀，检测免疫沉淀复合物中是否有NS及p27。如图1A所示，结 果表明，两者在肝癌组织中存在相互作用。
[0026]免疫荧光分析NS蛋白和ρ27在肝癌细胞中的共定位情况。在Huh7和Hep3B肝癌细胞 系中，以Lipof ectamine 2000转染NS-Flag载体，转染36h后进行免疫荧光分析NS蛋白和p27 在肝癌细胞中的共定位情况。结果表明，如图1B所示，NS蛋白和p27在肝癌细胞内存在明显 的共定位，且两者均存在明显的细胞核仁分布。
[0027] (2)NS蛋白通过其118-228片段和p27进行相互作用。
[0028]分别构建NS蛋白的不同截断片段，如图2上部所示，将NS蛋白按照其结构域分为1_ 123aa，118-228aa和289-550aa三个截断片段。将这三个截断片段均构建至pCMV-N-Flag载 体中，将构建好的NS蛋白截断载体和p27-myc全长载体进行共转染至293T细胞中。转染36h 后，收集细胞进行免疫沉淀实验，以Flag抗体进行免疫沉淀，分析NS的哪个片段可以和p27 存在相互作用。免疫沉淀结果表明，如图2下部所示，NS 118_228aa截断片段和p27存在直接相互 作用。
[0029 ]二、下述内容为本发明的抑制肿瘤细胞增殖的多肽类似物的真核表达载体的重组 步骤。
[0030] S101、多肽类似物的克隆载体构建。
[0031 ]以DMEM培养基添加10%胎牛血清体外培养人的Huh7肝癌细胞系，在细胞处于指数 生长期，添加 lml的Trizol裂解液提取Huh7细胞中的总RNA。将总RNA进行反转录成人的肝癌 细胞cDNA文库，应用PCR技术成功扩增出对应的cDNA序列。扩增得到的片段与质粒载体连 接，将连接产物转入感受态大肠杆菌中，在含Amp+琼脂平板上挑选克隆质粒，以碱裂解法小 提重组质粒后，以EC0R1酶切鉴定。
[0032] S102、多肽类似物真核表达载体构建及其表达检测。
[0033]将S101的克隆质粒和质粒pCMV-N-Flag双酶切后，利用回收试剂盒获得目的片段 和载体连接。经转化、提取等步骤获得重组真核表达载体Flag-NSm，谱如图3所示。酶 切鉴定重组体，并且测序进一步确定，测序结果。将正确连接的多肽真核表达载体转染肿瘤 细胞HepG2细胞系，48小时后搜集样品