表达耐热谷胺酰内肽酶的工程菌、制备方法及应用
【专利说明】表达耐热谷胺酿内肽酶的工程菌、制备方法及应用
[0001]发明所属领域：
[0002] 本发明涉及生物工程领域，具体说，本发明涉及表达耐热谷胺酰内肽酶的基因工 程菌的构建，耐热谷胺酰内肽酶的制备方法及应用。
【背景技术】：
[0003] 谷胺酰内肽酶具有很强的底物特异性，它们特异性地水解蛋白质或多肽底物中谷 氨酸或天冬氨酸羧基端所形成的肽键，而且这类酶水解谷氨酸α_羧基端所形成肽键的效 率是它们水解天冬氨酸α -羧基端所形成肽键的1 0 0 - 1 0 0 0倍（S ? r e n s e n e t al.1991.Fragmentation of proteins by S.aureus strain V8protease.FEBS Lett 294:195-197)。目前已知的谷胺酰内肽酶大多数来源于中温细菌，并已得到广泛研究。早期 研究所发现的来自金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)的谷胺酰内肽酶(也称为V8 蛋白酶、Glu-C或SspA)分子量大小为29kDa，在pH 4 · 0-7 · 8条件下酶活性最高(Drapeau et al..1972.Purification and properties of an extracellular protease of Staphylococcus aureus.J Biol Chem 247:6720-6726)。随后，人们陆续在芽抱杆菌属、链 霉菌属和肠球菌属等中温细菌中分离到谷胺酰内肽酶。绝大部分的谷胺酰内肽酶都是胞外 酶，在细胞内以前体的形式合成，由信号肽引导分泌到胞外，并且大多数谷胺酰内肽酶不能 自加工形成有活性的成熟酶，它们的活化依赖于其它蛋白酶对酶原的N端前肽进行加工切 除。目前绝大多数谷胺酰内肽酶是从原宿主的发酵液上清中纯化获得的，获得率低，纯化产 物中可能会含有中间体形式，而通过基因工程构建的重组酶在大肠杆菌中不能自加工形成 成熟酶，不利于它们的应用。
[0004] 谷胺酰内肽酶对阴离子去垢剂SDS有一定的耐受性，在0.1 % -0.2 %的SDS存在的 条件下依然可以保持一定的活性，这也为其在质谱测序领域的应用奠定了基础。由于谷胺 酰内肽酶具有高度的底物特异性，它们不仅作为工具酶在蛋白质结构分析和基于质谱技 术的蛋白质组研究中得到有效应用（Gupta et al.2010.Analyzing protease specificity and detecting in vivo proteolytic events using tandem mass spectrometry · Proteomics 10:2833-2844)，而且在食品及饲料加工、多肽合成等领域也具 有广泛的应用价值。但是，来源于中温细菌的谷胺酰内肽酶为嗜温酶，最适反应温度在37-65 °C 之间（Leshchinskaya et al . 1997 . Glutamyl endopeptidase of Bacillus intermedius,strain 3-19.FEBS Lett 404:241-244)，稳定性较差，在较高温度条件下易 失活，因而在实际生产和应用中受到限制。特别是，蛋白质底物在高温条件变性后，原来埋 在分子内部的肽键暴露而利于酶分子接近并水解，目前制备的谷胺酰内肽酶在酶制剂的生 产、储存和运输过程中稳定性差，货架期缩短，由于酶失活造成重大经济损失。
[0005] 迄今为止，只有Demidyuk等于1997年报道从高温放线菌(Thermoactinomyces)中 分离到一种谷胺酰内肽酶，但该酶最适反应温度仅为55°C，在65°C保温30min后即失活，并 未显不出耐热酶的特性（Demidyuk et al.，1997.Purification and characterization of serine Glu-Asp-specif ic proteinase from Thermoactinomyces species.Biochemistry(Moscow)62:414-422)〇
[0006] 发明技术内容：
[0007] 本发明的一个目的是提供一种新的基因工程菌株，该菌株高效表达的耐热谷胺酰 内肽酶耐高温，热稳定性好，在生产、储存和运输过程中稳定，具有较长的货架期。
[0008] 本发明的另一个目的是提供一种制备表达耐热谷胺酰内肽酶的基因工程菌的方 法。
[0009] 本发明的再一个目的是提供制备耐热谷胺酰内肽酶的方法。
[0010] 本发明的第四个目的是耐热谷胺酰内肽酶在高温条件下应用于蛋白质底物的水 解。
[0011] 本发明公开了一株新的可高效表达耐热谷胺酰内肽酶的基因工程菌，其特征在 于：由嗜热细菌Thermoactinomyces sp.CDF的基因组为模板经克隆得到的耐热谷胺酰内肽 酶TS-GSE的基因插入载体pET-26b( + )中得到重组表达质粒pET-26b-TS-GSE于大肠杆菌 BL21(DE3)中转化得到的基因工程菌，该工程菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号 是CCTCC N0:M2015771，菌株名称为大肠杆菌BL21(DE3)/pET-26b-TS-GSE，Escherichia co 1 i BL21 (DE3)/pET-26b-TS-GSE，保藏日期是2015年12月23日。中国典型培养物保藏中心 位于湖北省武汉市武昌区武汉大学校内，电话:027-68752319,EMAIL: cctcciwhu.edu.cn. 在本发明公开后，第三方研究者可依法从保藏机构获取菌种再现本发明的技术内容。
[0012] 在本发明中，采用CTAB/NaCl法提取高温放线菌⑶F(Thermoactinomyces sp.CDF) 的基因组DNA，以嗜热细菌Thermoactinomyces sp.CDF的基因组为模板经克隆得到的耐热 谷胺酰内肽酶TS-GSE基因插入载体pET-26b (+)中得到重组表达质粒pET-26b-TS-GSE于大 肠杆菌BL21(DE3)中转化得到的基因工程菌，该工程菌株保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏编号CCTCC N0:M2015771，菌株名称为大肠杆菌BL21(DE3)/pET-26b-TS-GSE， Escherichia coli BL21(DE3)/pET_26b-TS_GSE。高温放线菌Thermoactinomyces sp.CDF 由本室分离，菌种保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC AB 206328。
[0013] 本发明还公开了制备表达耐热谷胺酰内肽酶的基因工程菌的方法，包括引物设 计，重组表达质粒构造和宿主菌株转化，其特征在于：
[0014] 1)引物设计是根据嗜热细菌Thermoactinomyces sp.CDF中的耐热谷胺酰内肽酶 TS-GSE的基因序列和表达载体pET-26b( + )的序列特征，设计含有Nde I酶切位点的上游引 物和含有BamH頂每切位点的下游引物，
[0015]上游引物SEQ ID N0:1核苷酸序列是：
[0016] 5 '-CGGCATATGAAAGCCGATGCAGTGTTTGCC-3 '
[0017]下游引物SEQ ID歡2核苷酸序列是：
[0018] 5 '-CGCGGATCCCTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTGGTCTTTCCAAGTGTTCAG-3 '
[0019] 2)重组表达质粒构造是以耐热谷胺酰内肽酶TS-GSE基因序列为模板，运用PCR扩 增技术，得到克隆产物，用Nde頂每和BamH頂每双酶切，并将酶切产物连接到载体pET-26b (+ )的双酶切位点上得到重组表达质粒pET-26b-TS-GSE。
[0020] 3)宿主菌株转化就是将重组表达质粒pET-26b-TS-GSE转化到大肠杆菌BL21(DE3) 中，经卡那霉素筛选并验证后获得表达耐热谷胺酰内肽酶的基因工程菌BL21(DE3)/pET-26b-TS-GSE。
[0021 ] 在本发明中，本发明人以嗜热细菌Thermoactinomyces sp.CDF的基因组为模板经 克隆得到的耐热谷胺酰内肽酶TS-GSE基因插入载体pET-26b( + )中得到重组表达质粒pET-26b-TS-GSE于大肠杆菌BL21 (DE3)中转化得到基因工程菌。