一种利用木质纤维素原料生产胶质芽孢杆菌液体菌剂的方法
【技术领域】
[0001]本申请涉及生物质资源化利用和农业废弃物综合利用的领域，具体涉及一种利用木质纤维素原料生产胶质芽孢杆菌液体菌剂的方法。
【背景技术】
[0002]我国是农业生产大国，拥有丰富的木质纤维素原料，仅农作物秸杆每年就会产生7亿多吨，其中玉米秸杆、小麦秸杆和稻杆是我国的三大类秸杆。除了少部分被利用外，每年有数亿吨的秸杆被直接焚烧或成为固体废弃物，造成了资源浪费及环境污染。
[0003]木质纤维素原料中纤维素约占35-45%，半纤维素约占20-40%，若采用适宜技术将它们降解成可发酵性糖，然后利用微生物进一步发酵生产生物基化学品，不论对农业资源废弃物的再利用，缓解能源危机，还是减少环境污染等方面都具有十分重要的意义。现有技术中已经利用木质纤维素原料发酵生产如乙醇、丁醇、丙酮、氢气、谷氨酸、柠檬酸等。
[0004]在木质纤维素预处理方面，目前一般采用机械法、稀酸法、碱法、生物酶解法等。稀酸法或碱法会导致形成大量的酸碱废液，造成环境污染，且处理过程中会形成羟甲基糠醛等发酵抑制物，进而影响葡萄糖的转化率。
[0005]胶质芽孢杆菌(Bacillus mucitaginosus)，又称娃酸盐细菌，能生长于长石、云母、磷灰石等矿物上，并分解释放出钾、磷等营养元素，提高土壤中的可溶性磷和钾供植物生长利用，同时可代谢产生有利于植物生长的有机酸、氨基酸等营养物质，增强土壤蔗糖酶、脲酶和磷酸酶的活性，改善土壤生态，提高土壤肥力并达到增产效果，是一种良好的生物肥料生产用菌株。但是传统的胶质芽孢杆菌菌剂生产中存在活菌数不高、芽孢产率不稳定等问题。
【发明内容】
[0006]本申请提供了一种利用木质纤维素原料生产胶质芽孢杆菌液体菌剂的方法，包括如下步骤:(I)将木质纤维素原料粉碎成40-60目的颗粒，进行水热处理，获得悬浊液；(2)向步骤(I)获得的悬浊液中加入纤维素酶，酶解，离心去除残渣，获得含葡萄糖的酶解液；(3)加入培养基组分，接入胶质芽孢杆菌，于37 °C，pH 7.0，200rpm的条件下培养，获得胶质芽孢杆菌菌体细胞；(4)将步骤(3)获得的胶质芽孢杆菌菌体细胞加入无机盐缓冲体系中，获得胶质芽孢杆菌液体菌剂。在一些实施方案中，所述步骤(I)中，所述水热处理的条件为140-180 °C,0.8-1.2MPa，10_20min。在一些实施方案中，所述步骤(2)中，所述酶解的条件为:按照15FPU/g木质纤维素原料的用量加入纤维素酶，于55°C，pH 4.5-4.8,100_150rpm的条件下反应40-50h ο在一些实施方案中，所述步骤(2)中，获得的酶解液中葡萄糖的浓度为50?60g/L ο在一些实施方案中，所述步骤(3)中，所述培养基组分及其浓度为:磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.05g/L、硫酸钱5g/L、酵母膏0.5g/L。在一些实施方案中，所述步骤(4)中，所述无机盐缓冲体系的成分为:磷酸二氢钾5g/L;磷酸氢二钾8g/L;硫酸镁0.5g/L;硫酸亚铁0.02g/L；氯化钙0.05g/L；硫酸锰0.01g/L;硫酸锌0.005g/L，pH 7.0-7.2。在一些实施方案中，所述木质纤维素原料包括玉米秸杆、小麦秸杆和/或水稻秸杆，优选玉米秸杆。
[0007]本申请还提供了根据本申请的方法生产的胶质芽孢杆菌液体菌剂。
[0008]本申请提出一种利用木质纤维素原料生产胶质芽孢杆菌液体菌剂的方法，为实现上述目的，本申请采取如下技术方案:
[0009]1、木质纤维素原料的预处理
[0010]将木质纤维素原料用粉碎机粉碎成颗粒，放入水热反应釜中，配成悬浊液，于合适的条件下处理一段时间后，降温待用。
[0011]2、纤维素酶酶解
[0012]向步骤I获得的悬浊液中按照合适的用量加入纤维素酶，合适的条件下反应一段时间，离心去除残渣，获得酶解液。
[0013]3.胶质芽孢杆菌的发酵
[0014]在步骤2获得的酶解液中，加入磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸铵、酵母膏等组分后，接入胶质芽孢杆菌，于合适的条件下发酵培养，当菌体生长进入稳定期，且芽孢产率达到80%以上时，发酵结束，离心收集菌体。
[0015]4.菌剂制备
[0016]将步骤3所得的胶质芽孢杆菌菌体，按照合适的浓度加入至无机盐缓冲体系中，SP可获得胶质芽孢杆菌液体菌剂。
[0017]有益效果
[0018]本申请采取一种水热处理方法，结合生物酶解法，与现有技术的木质纤维素预处理方法相比，提高纤维素的水解效率，实现木质纤维素的高效利用。
[0019]本申请采用木质纤维素的酶解液，替代传统发酵培养基中的淀粉、豆柏等成分，提高胶质芽孢杆菌的芽孢产率，实现木质纤维素原料的增值利用。
[0020]本申请采用水热处理技术进行木质纤维素原料的预处理，时间短、效率高、纤维素水解比较彻底，且水解副产物少，并将其用于胶质芽孢杆菌的发酵生产，提高了木质纤维素原料的利用效率。
【具体实施方式】
[0021]接下来，通过实施例对本申请进行进一步详细地说明，但本申请不仅限于这些实施例。应当理解，可以采用其他实施方式，并且可以做出适当的改变而不偏离本申请的精神或范围。为了避免对于使本领域技术人员能够实践本申请来说不必要的细节，说明书可能省略了对于本领域技术人员来说已知的某些信息。因此，以下详细描述不应以限制性的意义来理解，且本申请的范围仅由所附权利要求界定。
[0022]下述实施例中所使用的各原料，除特别指出的以外，均可由市售获得。
[0023]实验方法
[OO24 ] (I)活菌数的计数方法:
[0025]预先制备营养琼脂培养基培养皿。取样后，在无菌条件下，对发酵液进行梯度稀释，取10yL适宜稀释度的菌液涂布平板，于30°C恒温培养倒置培养24-48h后计算活菌数。具体方法如下:取7支装有4.5mL无菌水的试管，以10—llO—7依次编号，用移液枪从发酵培养基中吸取0.5mL，放入编号10—1离心管，摇晃混匀，制成I O—1的菌液，依此类推，直到第七管编号10—7的离心管，制成不同稀释度的菌液。然后吸取0.1mL不同稀释度的菌悬液于灭菌的平皿内，用玻璃刮刀进行涂布，每一稀释度的培养基做3个重复，倒置培养后进行计数。
[0026]活菌数的计算公式为:
[0027]ImL原发酵液中的活菌数=同一稀释度三个以上重复平皿菌落的平均数X稀释倍数X 10
[0028](2)芽孢产率的计算方法
[0029]芽孢计数法是指将发酵液于恒温80°C水浴1min后，迅速置于冷水中冷却，然后稀释涂布，具体方法同上。
[0030]芽孢产率是活菌计数法得到的芽孢数和总菌数的百分比。
[0031]试剂来源及类型如下:
[0032](I)酵母膏，Oxide，生化试剂；
[0033](2)淀粉、蔗糖和豆柏由河北灵山鹤植物蛋白制造有限公司提供；
[0034](3)磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸铵、氯化钙、硫酸、硫酸锰、硫酸锌均为国产分析纯试剂，任一厂家均可。
[0035]实施例1木质纤维素原料的预