一种水稻非胚乳表达启动子safes3及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术和作物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种水稻 非胚乳表达启动子及其应用，该启动子能够驱动目标基因在水稻胚乳以外组织中特异表 达，从而可在不影响胚乳食用安全情况下，达到通过改变非胚乳结构特性改良水稻性状的 目的。
【背景技术】
[0002] 水稻是最重要的农作物之一，全世界有三分之一以上的人口以稻米为主粮。在我 国，水稻的生产面积约占农作物种植面积的40%，水稻生产在国民经济中占有非常重要的 地位。由于自然环境的不断变化和经济发展的需要，常规育种技术很难解决的一些生产实 际问题，如虫害、病害和逆境胁迫等，需要寻求现代生物技术解决。转基因技术因可在基因 水平上改造植物的遗传物质，定向改变植物的遗传性状，打破导入外源基因在物种间的生 殖隔离，实现了基因资源的优势互补。因此，转基因技术是实现水稻品种改良的一种重要手 段。
[0003] 水稻作为主要的粮食之一，水稻食用部位精米即胚乳。在转基因水稻中尤以外源 蛋白在胚乳中的积累及其可能造成的食用安全风险，成为制约商业化进程的重要因素。针 对这一问题，利用启动子策略即选用诱导型、组织特异性及时间依赖型启动子，使外源基因 只在非食用部分表达，保证食用部分不含有外源基因表达的产物，降低其对人类健康带来 的潜在风险，是促进转基因水稻的商业化进程的一条有效途径。目前国内研究中，非胚乳表 达启动子的发明鲜有报道，仅见于杨剑波等发明的水稻非胚乳表达启动子OsTSP I即只在 水稻非胚乳组织(根、茎、叶等）中表达，在胚乳中不表达。以及Meng Cai等发现的仅在水稻 绿色组织部位表达的启动子Η)540。
[0004] 如果转基因水稻不能最终实现商品化应用于生产，那么再好的研究成果也没有任 何应用价值。针对以上问题，目前需要大力开展功能基因组的研究，大量挖掘和分离具有实 用价值的非胚乳表达启动子，消除公众对转基因水稻的偏见和顾虑，并利用非胚乳表达启 动子的特性，充分发挥转基因育种的优势，培育出更多更好的新品种。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种在水稻非胚乳表达的启动子、获得含有该启动子序列的 转化子以及该启动子的应用。
[0006] 为了实现上述目的，一方面，本发明提供一种水稻非胚乳表达启动子SAFES3,其特 征在于，所述水稻非胚乳表达启动子SAFES3包含：
[0007] (a)SEQ ID N0:1中所示的核苷酸序列;或者 [0008] (b)SEQ ID N0:2中所示的核苷酸序列;或者
[0009] (c)在SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列中添加一个或多个核苷酸后所获得的核 苷酸序列;或者
[0010] (d)在SEQ ID N0:2中所示的核苷酸序列中添加一个或多个核苷酸后所获得的核 苷酸序列;或者
[0011] (e)与SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列具有至少90%同源性的核苷酸序列;或者
[0012] (f)与SEQ ID N0:2中所示的核苷酸序列具有至少90%同源性的核苷酸序列;或者
[0013] (g)在SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列中取代一个或多个核苷酸后所获得的核 苷酸序列;或者
[0014] (h)在SEQ ID N0:2中所示的核苷酸序列中取代一个或多个核苷酸后所获得的核 苷酸序列;或者
[0015] (i)SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列缺失一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸 序列;或者
[0016] (j)SEQ ID N0: 2中所示的核苷酸序列缺失一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸 序列;或者
[0017] (k)与带有SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列的植物杂交后所获得的相应产物的 对应核苷酸序列;或者
[0018] (1)与带有SEQ ID N0:2中所示的核苷酸序列的植物杂交后所获得的相应产物的 对应核苷酸序列。
[0019] 优选地，所述水稻非胚乳表达启动子由序列表中SEQ ID No: 1所示的DNA序列或 SEQ ID N0:2中所示的DNA序列构成。序列表中SEQ ID No:l或2所示的DNA序列为来源于日 本晴水稻（Oryza sativa L cv.Nipponbare)的序列，本文中称为SAFES3或启动子SAFES3。 具体而言，本申请的发明人发现日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)基因组中一 段2069bp的具有转录调控的DNA序列具有驱动目标基因在水稻非胚乳组织表达的作用。并 且分离克隆得到了序列表中SEQ ID No: 1所示的DNA序列。
[0020] 需要说明的是：SEQ ID No: 1的启动子的DNA序列中，序列开头的序列 "TCACAATCCCAGTTAGCCCTCA"为获得启动子过程中使用的正向引物的留存序列，共计22bp; 序列末尾的序列"GCTAAGCCTACGTACGGTGGTC"为获得启动子过程中使用的反向引物的留存 序列(该留存序列与反向引物的相应序列互补），共计22bp;该DNA序列中剩余的部分则为获 自日本晴水稻中的DNA序列，去除头尾部分则为SEQ ID No:2所示序列。需要强调的是，本文 中所提到的启动子既可以指上述整个DNA序列，也可以指去除上述引物留存序列后的DNA序 列。即便本领域技术人员在本发明的基础上，采用其他引物获得了类似序列，其也落入本发 明的保护范围之内。
[0021] 另一方面，本发明还提供一种包含上述水稻非胚乳表达启动子的表达盒。
[0022] 又一方面，本发明还提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含上述的水稻 非胚乳表达启动子，在所述重组表达载体中，所述水稻非胚乳表达启动子连接于待表达的 基因序列的上游；优选地，所述待表达的基因为Gus基因，所述重组表达载体为 PCAMBIA1391-SAFES3,该重组表达载体为将SEQ ID No:l所示的序列即SAFES3或启动子 SAFES3构建于pCAMBIAl 391中得到的重组表达载体，本文中称为pCAMBIAl 391-SAFES3。
[0023] 或者待表达基因可以为任何对水稻的非胚乳组织性状具有改善能力的基因。通过 本发明的启动子驱动该基因在非胚乳组织中特异性地集中表达，从而实现改善水稻非胚乳 组织相应性状的功能，而不会对胚乳带来任何改变或不利影响。
[0024]再一方面，本发明提供上述水稻非胚乳表达启动子在培育转基因水稻中的应用。 所述应用包括将本发明提供的上述水稻非胚乳表达启动子连接于载体的待表达的基因序 列上游(例如，将所述启动子序列置于/插入目标基因之前），从而构建重组表达载体，将所 述重组表达载体转化到水稻细胞、组织或器官中进行培育。
[0025]本发明中所提供的启动子的DNA序列为(与序列表中SEQ ID N〇:l中相同）：
[0026] 综上所述，本发明的发明人发现、提取并鉴定了日本晴水稻（Oryza sativa L cv.Nipponbare)中一段具有转录调控活性的2069bp的DNA序列，并将其命名为SAFES3(序列 表中的SEQ ID N〇:l或2)。具体而言，发明人发现该序列具有驱动基因在水稻非胚乳组织中 特异性表达的能力，提取出该序列并对上述能力进行了鉴定。发明人将该序列经酶切后连 接到作物双元表达载体PCAMBIA1391上，获得相应的重组质粒（即重组表达载体），利用该重 组质粒转化根癌农杆菌菌株EHA105,然后用农杆菌介导的方法进行水稻的转化，得到转基 因水稻植株。对获得的转基因水稻进行组织化学检测发现，转基因植株在根、茎、叶鞘、叶、 胚等非胚乳组织中有蓝色出现，在胚乳中没有着色，从而证明该2069bp的序列具有驱动基 因特异的在非胚乳组织中表达的活性。
[0027] 本发明所述的启动子序列可与作物双元表达载体连接，用于取代组成型启动子。 并且，该启动子序列可以与所需的靶标基因连接，构建重组作物表达载体，经转化后，可在 非胚乳组织中特异的驱动靶标基因的表达。
[0028]技术效果
[0029] 本发明所克隆的水稻启动子SAFES3能够调控基因在植株中非胚乳部位集中表达， 在实际应用中具有显著价值。如通过该启动子调控目标基因在绿色组织和根中表达活性， 而在胚乳中不表达，改善水稻的生长性能，同时降低了水稻的食用安全风险，有助转基因水 稻的商业推广。
【附图说明】
[0030] 以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
[0031] 图1为将SAFES3启动子构建于PCAMBIA1391载体质粒中的示意图，其中图1中A为 PCAMBIA1391示意图，B为pCAMBIA1391-SAFES3示意图，其中示出了利用SAFES3启动子驱动 位于其下游的Gus基因表达；
[0032] 图2为对本发明的启动子进行酶切验证的结果示意图。
[0033]图3为利用SAFES3启动子驱动Gus基因表达的结果示意图，示出了水稻各部位Gus 染色结果，其中示出了SAFES3: : gus转基因水稻植株，其中a表示根，b表示茎，c表示叶鞘，d 表示叶，e表示种子纵切图；从图中可以看出，除e以外各组织均有蓝色出现，e仅在胚部位出 现蓝色。图中标尺=lcm。
【具体实施方式】
[0034] 以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅 用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
[0035] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的生 化试剂，载体耗材等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
[0036]含有酶切位点的SAFES3启动子的获得 [0037]步骤1、引物的设计
[0038] 根据NCBI中提供的水稻品种日本晴（Oryza sativa L cv.Nipponbare)全基因组 序列，依据水稻SAFES3基因的序列设计扩增引物，并根据选用的载体及靶标基因的特点，设 计引物的酶切位点。
[0039] 本实施例中以水稻双元表达载体pCAMBIA1391 (图1中A部分，来自于CAMBIA，公开 使用载体，安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存） 为例，靶标基因为Gus基因，具体设计