一种重组牦牛溶菌酶及其制备方法和用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种重组牦牛溶菌酶及其制备方法和用途。
【背景技术】
[0002] 溶菌酶是一种碱性蛋白质，广泛分布于动物、植物和微生物中，并且在哺乳动物的 血浆、气管、肠道、胃、肾和肝等组织细胞中均有所表达。其通过破坏肽聚糖中N-乙酰胞壁 酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β_1，4糖苷键，导致细胞壁结构改变，从而使细菌溶解。溶菌 酶由于具有抗菌能力，并且无毒、副作用，可作为潜在的抗生素替代品运用于食品、生物工 程、医疗、畜禽饲料等领域。从家畜疾病控制方面考虑，溶菌酶作为添加剂而使用于饲料工 业及养殖业中的疾病防治，实现疾病防治的高效、无毒、无残留、无抗药性、无停药期，可实 现对抗生素的部分替代。
[0003] 我国是饲料生产大国，2013年全国工业饲料总产量近2亿吨。目前市场销售的主 要是鸡蛋溶菌酶和微生物溶菌酶，在饲料中的添加200~250克溶菌酶可替代30%的氧化 锌及30 %的抗生素，市场潜力巨大。溶菌酶能有效控制仔猪腹泻，提高采食量、促进生长、消 除氧化锌的副作用。已有试验表明在加氧化锌的基础上加200克溶菌酶，能完全消除氧化 锌的后遗症。溶菌酶在治疗动物细菌性腹泻时可以完全替代抗生素。实验表明在治疗体重 小于30公斤的仔猪腹泻时，用0. 5克溶菌酶每头每天的治疗量，每天灌服2次，2~3天能 基本治愈。溶菌酶还可用作为肠道用药、呼吸道用药、对兽药进行增效、用于伤口修复消毒 消炎等方面。
[0004] 但是，饲料工业中使用的溶菌酶不能抵抗胃液中的胃蛋白酶，并且在酸性的pH环 境下活性受到抑制，同时也难以耐受饲料加工中的高温过程。因此，需要开发具备此性质的 饲料用溶菌酶。
[0005] 反刍动物的胃溶菌酶存在于复胃中，与来自其它动物的溶菌酶相比，该溶菌酶具 有抗胃蛋白酶的特性，并且在酸性环境下活性更好。这些特性使其不需包埋就可进入肠道 发挥作用，促进畜禽健康，加上该酶活性与目前市售溶菌酶活性相当，使该酶具备潜在的商 业应用价值。
[0006] 牦牛是青藏高原地区的珍贵稀有的草食家畜，牦牛溶菌酶具有抗酸、抗胃蛋白酶 活性，但是直接从牦牛皱胃中提取的牦牛溶菌酶的量难以满足市场需求，采用基因工程的 方式制备牦牛溶菌酶可以降低成本，然而，制备得到一种可以表达有活性的牦牛溶菌酶的 重组菌并非易事，目前未见采用基因工程的方式制备牦牛溶菌酶的报道。
【发明内容】
[0007] 为了解决上述问题，本发明提供了一种重组牦牛溶菌酶。
[0008] 本发明提供了一种如SEQ ID N0 :1所示的核苷酸序列。
[0009] 还提供了一种重组载体，它包含SEQ ID N0 :1所示的核苷酸序列。
[0010] 其中，所述的重组载体是重组pPICZ α质粒，g卩pPICZ a -HYL质粒。
[0011] 还提供了一种重组菌，它包含前述的重组载体。
[0012] 其中，所述的重组菌为重组毕赤酵母。
[0013] 还提供了一种溶菌酶，它由SEQ ID N0 :1所示的核苷酸序列编码。其中，它的氨基 酸序列如SEQ ID N0 :2所示。
[0014] 本发明还提供了一种制备前述溶菌酶的方法，其特征在于：包含如下步骤：
[0015] i、取前述重组菌，接种到BMGY培养基上培养，培养温度为28-30°C，pH为6. 0,至 OD600 = 2 ~6 ;
[0016] ii、收集菌体，用BMMY培养基重悬至0D_ = 1，加入甲醇至浓度0· 5% (v/v)进行 诱导表达，之后每24小时添加一次甲醇，每次添加甲醇至浓度为0. 5% (v/v)，诱导表达的 培养温度为30°C，pH为6. 0,诱导表达的时间为24~96h ;
[0017] iii、离心，取上清，分离纯化，即得。
[0018] 所述分离纯化步骤如下：
[0019] (1)含重组溶菌酶上清制备：在待分离溶液中，加入2倍体积的醋酸铵溶液，匀浆， 离心，分离上清液和沉淀，再在沉淀中再加入醋酸铵溶液，醋酸铵溶液的加入量为沉淀量的 2倍（v/w)，离心，合并含重组溶菌酶的上清液；其中，醋酸铵溶液的浓度为10mM ;
[0020] (2)粗纯：调节含重组溶菌酶的上清液的pH至4,离心，取上清液，在沸水浴中加热 2min，待温度降至室温，再调pH至5,离心，得上清，即为粗纯液；
[0021] (3)CM_Sepharose FF柱层析：采用浓度为10mM的醋酸铵溶液平衡CM-Sepharose FF柱，取步骤（2)的粗纯液上样，用浓度为10mM的醋酸铵洗脱杂蛋白，再用浓度为10mM~ 300mM的醋酸铵溶液线性梯度洗脱，根据洗脱图谱，收集第二个峰对应的溶液，即为层析 液；
[0022] (4)S印hadex G-75柱层析：采用浓度为0· 2% (v/v)醋酸溶液平衡S印hadex G-75 柱，取步骤（3)的层析液上样，用浓度为0.2% (v/v)的醋酸溶液洗脱，根据洗脱图谱，收集 最后一个峰对应的溶液，即得牦牛胃溶菌酶溶液；
[0023] (5)冻干，即可。
[0024] 本发明还提供了前述溶菌酶在制备饲料添加剂或抗菌药物中的用途。
[0025] 本发明构建了一种新的表达重组牦牛溶菌酶的毕赤酵母工程菌，该工程菌制备的 重组牦牛溶菌酶的酶活高。采用本发明方法制备溶菌酶的方法简便，可工业生产，具有良好 的市场应用前景。
[0026] 以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内 容所实现的技术均属于本发明的范围。
【附图说明】
[0027] 图1重组表达质粒pPICZa -HYL的双酶切鉴定。Μ: λ -EcoT14I ;1:重组表达质粒 pPICZ a -HYL ;2 :重组表达质粒pPICZ a -HYL的双酶切。
[0028] 图2重组牦牛溶菌酶纯品的冻干品外观；
[0029] 图3重组牦牛溶菌酶纯品的SDS-PAGE电泳图谱；
[0030] 图4重组牦牛溶菌酶的抑菌实验。A和B表示发酵上清，C表示灭菌水。
【具体实施方式】
[0031] 实验材料和试剂：
[0032] 菌株、载体和培养基
[0033] 毕赤酵母X33及载体pET32a (+)、pPICZ α A商购获得，pMD19-T Vector购于宝生 物工程（大连）有限公司，大肠杆菌DH5 α购于Novagen公司。
[0034] LB培养基（10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、和10g/L NaCl，pH of7-7. 5.)加入 氨节青霉素（lOOug/mL)或者Zeocin(25yg/mL)用于大肠杆菌菌株DH5a的培养。
[0035] YPD培养基（10g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨、20g/L葡萄糖）加入 Zeocin (100 μ g/mL)被用于选择毕赤酵母X33转化菌株。
[0036] BMGY 培养基（20g/L 胰蛋白胨、10g/L 酵母提取物、3g/L K2HP04,、11. 8g/L ΚΗ2Ρ04、 lOOmL/L 10XYNB、lmL/L 500X 生物素 and lOmL/L 甘油）和 BMMY 培养基（20g/L 胰蛋白 胨、lOg/L 酵母提取物、3g/L KH2P04、11.8g/LKH2P04、100mL/L 10XYNB、lmL/L 500X 生物素 以及5mL/L甲醇）。
[0037] 试剂及工具酶
[0038] 质粒提取小量试剂盒购于Omega Genetics公司、2 X Taq PCR Master Mix及DNA 纯化回收试剂盒购于天根生化科技有限公司、溶菌酶检测试剂盒购于南京建成生物工程研 究所；Ex Taq DNA 聚合酶、限制性内切酶 KpnI、BamHI、NotI、XhoI、SacI&T4DNALigase 均购自宝生物工程（大连）有限公司。其它生物试剂为国产分析纯。
[0039] 实施例1本发明重组蛋白的制备
[0040] 1、重组表达
[0041] 1. 1基因克隆
[0042] a、合成重组目的基因：
[0043] 以2条牦牛胃溶菌酶基因片段以及1条牦牛乳溶菌酶基因片段作为亲本基因，采 用DNA Shuffling技术获得一段新的DNA片段，序列如SEQ ID N0 :1所示，命名为HYL :
[0044] ATGACTGCTCTCATTATTCTGGGGCTTCCCCTCCTTTCTGTTGCTGTCCATGGGAAGAAATTTCAGAGG TGTGAGCTTGCCACAACTCTGAAGAAACTTGGATTGGATGGCTATCGAGGAGTCAGCCTGGCAAACTGGGTGTGTTT GGCCAGATGGGAAAGCAATTACAACACACGAGCTTCAAACTACAATCGTAGAGACAAAAGCCCTGATTATGGGATAT TTCAAATCAATAGCCGCTGGTGGTGCAATGATGGCAAAACCCCAAAAGCAGTTAACGCCTGTCGTATACCCTGCATC GCTTTGCTGAAAGATGACCTCACTCAAGCTGTAGCATGTGCAAAGAACATTGTCAGTCATCAAGGAATTACAGCATG GGTGGCATGGAGAAAAAAAGTGTCAAAACCGAGATCTCAGGAGTTATGTTGA〇
[0045] b、重组目的基因与pMD19-T载体的连接及转化、筛选：
[0046] 合成上述序列，与PMD19-T进行连接，并转化DH5 α感受态细胞，涂布于含X-Gal 和IPTG的LB琼脂平板上，37°C倒置培养12-16小时，直至出现白色单菌落，构建突变体库。
[0047] 连接步骤如下：
[0048] 1)加入回收的目的DNA 4. 5 μ L、pMD19-T载体0· 5 μ L，轻轻混匀；
[0049] 2)加入 Solution I 5yL，混匀，