miR-331-5p作为急性HIV感染检测标志物中的应用
【技术领域】
[00011 本发明涉及一种急性HIV感染检测标志物，具体地说是miR-331-5p作为急性HIV感 染检测标志物中的应用。
【背景技术】
[0002] 艾滋病是由人类免疫缺陷病毒(HIV)感染所致的疾病，HIV感染后，病毒大量吞噬、 破坏T4淋巴细胞，从而使整个人体免疫系统遭到破坏，最终人体丧失对各种疾病的抵抗能 力而导致死亡。根据中国疾控中心发布的数据，截至2015年10月底，全国报告存活的艾滋病 病毒感染者和病人共计57.5万例，死亡17.7万人。艾滋病不仅影响广大人民群众的生命健 康，也给社会稳定和经济发展带来严重危害。
[0003] 急性HIV感染的诊断有利于早期发现和治疗，在艾滋病的防治工作中具有重要作 用。急性HIV感染时，HIV抗体尚未充分产生，诊断主要依靠 HIV抗原和核酸检测，HIV抗原检 测的敏感性为30~90%，仅为HIV感染的辅助诊断依据，而HIV核酸检测的价格昂贵。有关急 性HIV感染的诊断方法有待进一步提高和完善(Hoenigl M et al ·，Costs per Diagnosis of Acute HIV Infection in Community-based Screening Strategies:A Comparative Analysis of Four Screening Algorithms.Clin Infect Dis 2015；pi i:civ912.)〇
[0004] 由于microRNA能以稳定的形式广泛存在于包括血液、唾液和尿液等体液中，是一 种重要的生物标志物。因此，循环miRNA可以作为潜在的血液生物标记物，用于疾病检测，其 优势在于非侵入性地提取组织标本。研究显示，microRNA作为一种潜在的疾病诊断生物标 记物，在肿瘤、心血管疾病、糖尿病和感染性疾病诊断以及司法鉴定中具有重要的作用 (Faruq 0 et al.,microRNA:Diagnostic Perspective . Front Med(Lausanne)2015；2: 51.doi:10.3389/fmed.2015.00051.)〇
【发明内容】
[0005] 本发明的首要目的在于提供一种检测miR-331-5p表达水平的物质的新用途。
[0006] 本发明的第二目的在于提供一种含有上述物质的诊断或辅助诊断急性HIV感染的 试剂盒。
[0007] 为了实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
[0008] 检测miR-331-5p表达水平的物质在制备诊断或辅助诊断急性HIV感染患者产品中 的用途，其中，所述miR-331-5p核苷酸序列如SEQ ID No.l所示。
[0009] 检测miR-331-5p表达水平的物质在制备检测或辅助检测急性HIV感染的产品中的 用途，其中，所述miR-331-5p核苷酸序列如SEQ ID No.l所示。具体序列如下所示：
[0010] SEQ ID No.lCUAGGUAUGGUCCCAGGGAUCC
[0011] 所述检测miR-331-5p表达水平的物质为如下a)或b)或c):
[0012] a)扩增所述miR-331-5p的引物和/或探针；
[0013] b)含有所述a)的PCR试剂组；
[0014] c)含有所述a)或所述b)的试剂盒。
[0015] 所述引物包括序列如SEQ ID No.3所示的上游引物;及序列如SEQ ID No.4所示的 下游引物。
[0016] 上述具体序列如下：
[0017] SEQ ID No.3miR-331-5p-F：
[0018] GGCCTAGGTATGGTCCCAG
[0019] SEQ ID No.4miR-331-5p-R：
[0020] GTGCAGGGTCCGAGGT〇
[0021] miR-331-5p作为标志物在制备诊断或辅助诊断急性HIV感染患者产品中的用途， 所述miR-331-5p核苷酸序列如SEQ ID No.l所示。
[0022] 一种检测miR-331-5p表达水平的物质，其中，所述检测miR-331-5p表达水平的物 质为如下a)或b)或c):
[0023] a)扩增所述miR-331_5p的引物和/或探针；
[0024] b)含有所述a)的PCR试剂组；
[0025] c)含有所述a)或所述b)的试剂盒。
[0026] 所述扩增miR-331-5p的引物包括序列如SEQIDN0.3所示的上游引物，及序列如 SEQ ID No.4所示的下游引物。
[0027] -种诊断或辅助诊断急性HIV感染的试剂盒，其中，所述试剂盒包含上述的检测 miR-331-5p表达水平的物质。
[0028] 所述试剂盒组成为:上述SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示引物和PCR反应液。
[0029] 所述PCR反应液 12.5yL，其由Syber green I荧光染料0.5_1X、DNA聚合酶 100U/mL、 dNTPs 0.2mM、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐16.5mM、氯化钾89.3mM、氯化镁6mM和水组成。
[0030] 试剂盒中上游引物（SEQ ID Νο.3)(10μΜ)1μL，下游引物（SEQ ID Νο.4)(10μΜ)1μ L〇
[0031] 所述试剂盒还可以包括逆转录引物及内参体系，所述逆转录引物的序列如SEQ ID No.2所示;所述内参为U6,内参体系包括针对U6的逆转录引物及检测引物，逆转录引物序列 如SEQ ID No.5所示；检测引物序列如SEQ ID No.6及SEQ ID No.7所示。
[0032] 上述miR-331-5p表达水平为血浆表达水平。
[0033]本发明的有益效果如下：
[0034] 本发明利用实时定量PCR技术，待测样品为待测者血浆，通过检测被测血浆中miR-331-5p的含量，并通过与正常人群miR-331-5p水平比较以诊断急性HIV感染。本发明提出的 急性HIV感染标志物miR-331-5p预测急性HIV感染的AUC是0.941 (95 %置信区间：0.0.867-1. 〇〇〇 )，敏感度和准确度均为90 %。灵敏性高，特异性强，操作方便，有利于临床应用。本发 明所建立的急性期HIV感染诊断方法，为HIV感染的早期诊断提供了重要的参考依据。
【附图说明】
[0035] 图1为U6和miR-331-5p的标准曲线。
[0036]图2为血衆miR-331-5p在HIV感染前后表达水平比较示意图。与HIV感染前相比，血 衆miR-331-5p在HIV感染后显著升高。P = 0.001。
[0037] 图 3为血衆miR-33 l_5p诊断急性HIV感染的ROC曲线（Recei ver operat ing characteristic curve，R0C curve)及曲线下面积（Area under the curve，AUC)。图中显 示了急性HIV感染的ROC曲线、AUC、灵敏度(Sensitivity)和准确度(Specificity)。
【具体实施方式】
[0038] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0039] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0040] 实施例1临床血浆标本miR-331-5p表达与急性HIV感染的相关性实用性验证
[0041] 1.材料与标本收集描述
[0042] 标本均来自于佑安医院男男同性恋高危人群动态随访队列，每隔2个月随访一次， 采集全血后分离血浆和外周血单个核细胞冻存，选取20例急性HIV感染者感染前后的标本， 这些感染者均排除合并梅毒、乙肝和丙肝。
[0043] 2.血浆 miRNA 提取
[0044] 血衆RNA通过Qiagen的miRNeasy Serum/Plasma Kit试剂盒按照试剂盒说明书操 作步骤进行提取和纯化，具体步骤如下：
[0045] 2.1解冻冻存的血浆样本。
[0046] 2.2每10(^1^样本中加入50(^1^(>)]^2〇11^8丨8 1^386111:试剂，采用移液器反复吹打 混匀。
[0047] 2.3将混匀样品在室温下孵育5分钟。
[0048] 2 · 4加入100yL氯仿，振荡混匀15秒。
[0049] 2.5室温孵育2~15分钟。
[0050] 2.6在12000\8,4。(3下离心15分钟。
[0051] 2.7将上层液相物质转移至新的试管，在操作时避免吸入任何中间相或有机层物 质；加入150yL100%乙醇，采用移液器反复吹打混匀。
[0052] 2.8将样本加入RNeasy Mini spin小柱以10000Xg离心力，室温离心15秒。弃过滤 液。
[0053] 2.9重复2.8步骤离心一次。
[0054] 2 · 10加入700yL RWT缓冲液，以10000 X g离心力，室温离心15秒。弃过滤液。
[0055] 2.11加入50(^1^1?^缓冲液，以10000\8离心力，室温离心15秒。弃过滤液。
[0056] 2.12重复2.11步骤离心一次。
[0057] 2.13将RNeasy Mini spin小柱置于新的2mL离心管，12000g离心2分钟。
[0058] 2.14将RNeasy Mini spin小柱置于新的 1.5mL离心管，30_50yL RNase-free水，以 10000 Xg离心力，离心1分钟。将RNA洗脱备用。
[0059] 3.RNA 反转录<