一种高纯度雷帕霉素的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高纯度雷帕霉素的制备方法。
【背景技术】
[0002] 雷帕霉素（Rapamycin，RPM，PAPA),又名西罗莫司（Sirolimus)，是 1975 年由加 拿大Ayerst研究所从吸水链霉菌（Strepomyces hygroscopicus)中分离出来的Η帰大 环内醋类抗生素。雷帕霉素的分子式为Cs化gN〇i3,分子量914,为白色固体结晶，烙点为 183-185°C，亲脂性，溶解于甲醇、己醇、丙丽、氯仿等有机溶剂，极微溶于水，几乎不溶于己 離。其结构式为：
西罗莫司具有异构体B和异构体C，其中异构体B为主要活性成分，上述结构式为异构 体B，异构体C结构式如下：
1977年发现其具有重要的免疫抑制作用，1989年开始把其作为用于抗器官移植排斥 反应的新型高效免疫抑制剂进行研究，1999年9月美国FDA批准其适用于在临床上的肾移 植病人。在中国，西罗莫司口服液作为二类新药2002年获准进入国内临床。2005年6月福 建省微生物研究所研制研发的国产西罗莫司经S抑A批准投放市场。现在西罗莫瓦器已成 功开发为新型强效的免疫抵制剂，用于器官移植搞排斥反应，用于治疗自身免疫性疾病；用 于涂层支架，防止必脏血管再狭窄；作为mTOR祀向抗肿瘤药物，抑制肿瘤的生长等 CN102433364B提供了一种微生物发酵法制取雷帕霉素的工艺，其中，包括W下步骤： 先在斜面培养基中培养吸水链霉菌，然后转接于新鲜种子培养基中进行培养；将经所述种 子培养基培养的菌株按照2%的接种量接种至新鲜的发酵培养基中进行发酵培养，得到含 雷帕霉素的发酵液；将雷帕霉素发酵液加入娃藻±过滤，得到湿菌丝体，萃取、浓缩、结晶， 得到雷帕霉素粗品；然后再讲雷帕霉素粗品经硅胶柱层析纯化，最后重结晶得到雷帕霉素 终产品，纯度在95% W上。
[0003] 专利CN101133065A公开了一种通过化学方法来纯化雷帕霉素的方法。该方法纯 化方法包括用Η甲基氯娃焼处理雷帕霉素得到31，42-双-Η甲基甲娃基離，庚焼萃取，并 使31，42-双-Η甲基甲娃焼離脱保护从而产生纯化的雷帕霉素产物。该方法操做复杂，成 本较高，回收率低只能获得98. 7%纯度的雷帕霉素。
[0004] 专利CN 102464668 A公开了一种通过制备色谱纯化得到高纯度雷帕霉素的方法。 该方法用到了制备色谱，其设备、填料价格昂贵，生产成本高。
[0005] 专利CN 102070652 B公开了一种从发酵液中快速分离提取西罗莫司的方法，包括 将西罗莫司从发酵液中提取得到菌丝体，然后将菌丝体进行萃取、脱色得到粗提物，粗提物 通过高速逆流色谱分离，收集西罗莫司分离样品溶液，浓缩干燥，得到成品，该方法具有提 取步骤简单、节省溶剂等优点，但其采用高速逆流色谱分离，设备投入成本大，色谱上样量 小（目前到克级)，不适合工业规模生产，并且经过该方法只能得到纯度为90%的雷帕霉素产 品。
[0006] 专利CN102372726A公开了一种通过将西罗莫司菌丝体的浸提液进行吸附、萃取、 洗涂浓缩、洗涂、结晶、洗晶干燥等步骤，即可得到西罗莫司粗晶，该方法只能得到纯度为 95%的雷帕霉素。
[0007] 雷帕霉素的发酵产量低，从发酵液中分离提取雷帕霉素的难度大，现有工艺均存 在分离效率低，能耗高，随着雷帕霉素越来越多的进入临床的使用，急需找到一种成本低、 操作简单、高纯度的制备方法。
【发明内容】
[0008] 为了解决上述技术问题，本发明提供了一种产品纯度高，生产成本低的从发酵液 中分离纯化雷帕霉素的方法，包括：从雷帕霉素发酵液中分离得到菌丝体，然后将菌丝体用 丙丽浸提，固液分离得到浸提液；将雷帕霉素浸提液采用下述步骤进行操作： (1 )、萃取、脱色：将浸提液浓缩后，用己酸己醋萃取，得到己酸己醋相；向己酸己醋相 加入活性炭脱色，无水硫酸钢干燥； (2) 、硅胶柱层析；向步骤（1)干燥后的己酸己醋相中加入空白硅胶，浓缩成干粉，作为 上样硅胶击油離/己酸己醋作为洗脱剂，收集洗脱液，浓缩，得到粗品I ; (3) 大孔吸附树脂吸附；将步骤（2)得到的粗品I用己腊水溶液溶解，通过大孔吸附树 脂吸附，己腊水溶液作为解吸液，收集含雷帕霉素纯度高的解吸液；将解吸液真空浓缩，然 后加入二氯甲焼萃取，合并二氯甲焼相，浓缩至干，得到粗品II ; (4) 结晶；将粗品II用己離溶解，4°C 揽拌结晶，过滤收集晶体，在常温下真空干燥 得到纯化的雷帕霉素。
[0009] 其中，从雷帕霉素发酵液中分离得到菌丝体所用方法可W为压滤、抽滤或离必中 的一种或多种方式结合；浸提菌丝体所用丙丽的量约为菌丝体重量的：Γ4倍（v/w)。
[0010] 进一步的，所述步骤（1)萃取、脱色，优选将浸提液在5(TC下真空浓缩至几乎不含 有丙丽，然后将浓缩液用：Γ4倍（￥；^88；^@旨/胖,&^胃51.；*)己酸己脂萃取，分离得到己酸己醋相；将 己酸己醋相用0. 5^5倍（V自胃弱碱性溶液洗涂：Γ5次，直到下层水溶液无明显颜 色，所述所碱性溶液为质量浓度Ρ/Γ10%碳酸钢、碳酸氨钢、磯酸二氨钢或磯酸二氨钢的水 溶液；所述向己酸己醋相加入活性炭脱色，无水硫酸钢干燥，优选向己酸己醋相加入活性炭 后，加热到4(TC，脱色约30分钟，过滤，己酸己醋层加入无水硫酸钢干燥，过滤，收集己酸己 醋溶液；其中，活性炭的用量优选为0. 5%~10% (W活性炭/V己酸己J旨)，优选活性炭用量为1%-3% 活性炭/V己酸己醋)°
[0011] 进一步的，所述步骤（2)硅胶柱层析，优先将己酸己醋相中加入空白硅胶，然后 在小于5(TC下真空浓缩成干粉，作为上样硅胶，所述空白硅胶为球形非键合硅胶，粒径为 50-300目，用量为己酸己醋相中所含雷帕霉素质量的2^20倍，优选?Τ?Ο倍；装柱完成后， 优选采用干法上样；洗脱之前，优选先用石油離与己酸己醋的混合溶剂对硅胶柱进行梯度 预洗，所述预洗液石油離与己酸己醋体积比为2:8~5:5 ;该比例不是2:8~1:1范围中的某一 个比例，而是梯度洗脱的溶剂比例在此范围。所述预洗方法，例如可W是，在预洗过程中先 用2:8的石油離与己酸己醋预洗两倍柱体积；然后用3:7的石油離与己酸己醋预洗两倍柱 体积；再用4:6的石油離与己酸己醋预洗两倍柱体积；再用5:5的石油離与己酸己醋预洗 两倍柱体积，完成预洗。
[0012] 预洗完毕后，用石油離与己酸己醋的混合溶剂作为洗脱液对硅胶柱进行洗脱，，其 中，石油離与己酸己醋体积比为5: 5^3:7,最优选7:13洗脱完毕后收集洗脱液，将洗脱液在 温度小于5(TC真空浓缩至干粉，得到雷帕霉素粗品I，纯度为85% W上的雷帕霉素。
[0013] 进一步的，所述步骤（3)大孔吸附树脂吸附，优选将粗品I用己腊水溶液溶解，然 后通过大孔树脂吸附，其中，所述的己腊水溶液的浓度为40%~60%，优选50%，每克粗品I约 用40m广60ml，优选50ml所述的己腊水溶液。例如，2g粗品I先加入50ml己腊，溶解后揽 拌下加入等量的纯化水，揽拌均匀得到上柱液。所述大孔吸附树脂为一种聚苯己帰二己帰 基苯形成的大孔树脂，选自DIAI0N监20SS、化iPS40、监20SS和化iPS50组成的组，用量为 粗品II重量的100~500倍（W/V);更进一步的，优选大孔树脂为化iPS40。
[0014] 吸附完毕后，用己腊水溶液作为洗脱液进行洗脱，优先洗脱液优选浓度为40%~70% 的己腊水溶液，更优选，洗脱液浓度为63%的己腊水溶液。收集纯度较高组份，将纯度较高 组份在低于4(TC下真空浓缩至己腊浓度低于10%后迅速降温至4°C ^8°C。然后向浓缩液 中加入与浓缩液等体积的预先冷至4°C -8°C的二氯甲焼。揽拌30分钟，分层收集二氯甲焼 层。
[0015] 向二氯甲焼层中加入无水硫酸钢干燥，抽滤，将滤液在温度低于45°C下真空浓缩 至干。得到雷帕霉素粗品II。
[0016] 进一步的，所述步骤（4)结晶，优先将粗品II用己離溶解，揽拌下缓慢降温至 4Γ -8Γ揽拌结晶。过滤收集晶体，在25Γ下真空干燥得到纯化的雷帕霉素，其中优选所用 己離体积为粗品II重量的5~15倍粗品II)，更优选为8-10倍粗品II);所述纯 化的雷帕霉素 HPLC纯度高于99%。
[0017] 所述HPLC检测条件为：色谱柱；Kromasil C18柱；色谱柱规格；5 μ m， 4. 6mmX250mm ;流动相：体积比为甲醇：己腊：水=70:15:30的甲醇、己腊和水的混合溶 液；检测波长：277皿；柱温；40°C ;流速；Iml/min。
[0018] 本发明所用到的硅胶柱层析方法中，所用空白硅胶为一球形的非键和硅胶，其料 径为50~300目，优选200~300目；硅胶柱的规格为：径高比为1:5~1:15。优选1:8~1:10。 用量为雷帕霉素质量的50~150倍，最优选100~120倍。
[0019] 本发明提供的高纯度的雷帕霉素制备方法是一种具有工业化生产价值的新工艺， 主要具有如下优点和积极效果： 第一，在制备的过程中，两次柱层析都采用普通的常压柱而没有采用中压制备色谱，从 而大大减少了生产的前期设备投入，有效的降低了生产成本； 第二，本发明采用采用柱层析结合大孔吸附树脂的方法纯化雷帕霉素原理简单，操作 方便，对设备要求低，适合应用于工业化生产，柱层析采用石油離与己酸己醋的混合液做洗 脱液，相对现有技术中使用丙丽/己焼做洗脱液，分离效果好； 第H，本发明纯化效率高，纯化后得到的雷帕霉素 HPLC纯度在99% W上； 第四，与现有技术相比，本发明不仅得到的产品的纯度高，而且收率高。
【附图说明】
[0020] 图1显示实施例1中所用发酵液的HPLC图谱，雷帕霉素的保留时间约为4. 98min。 [002。 图2显示实施例1中己酸己醋经洗涂后的HPLC图谱，雷帕霉素的保留时间约为 6. 38min。
[002引图3显示按实施例2所制得的粗品I的HPLC图谱，雷帕霉素的保留时间约为 5. 37min。
[002引图4显示按实施例3所制的粗品II的HPLC图谱，雷帕霉素的保留时间约