一种与胃癌相关的血清/血浆lncRNA标志物试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程及肿瘤学领域，设及一种与胃癌相关的血清/血浆IncRNA标 志物试剂盒。
【背景技术】
[0002] 胃癌是世界第二高发肿瘤，同时也是胃肠道肿瘤中最常见肿瘤之一。尽管胃癌恶 性程度较高，但若能早期发现早期治疗，仍可获得最佳治疗效果，早期胃癌手术切除率为 90%-100%，5年生存率可达70%-100%，与进展期胃癌相比，两者治疗效果存在着巨大的 反差。但大部分患者就诊时已处于晚期。目前对胃癌的生物学标志进行了大量而广泛的研 究，包括基因标记、血清学标记和细胞学标记等，由于运些指标的特异性和敏感性各有差 异，对于早期胃癌目前还没有准确有效的筛查方法，也缺乏可靠的诊断措施。由鉴于此，胃 癌早期诊断率亟待提高，寻找有效的标志物对胃癌早期诊断、促进其预后有重要意义。
[0003] 非编码RNA(ncRNA)是近年来肿瘤分子生物学研究领域的一个热点，它分为miRNA 和IncRNAeLncRNA广泛存在于真核生物中，是一组不编码蛋白质的长度超过200nt的RNA分 子，本身不具有开放阅读框，且具有高度保守性、时序性和组织特异性，通过与祀mRNA结合， 降解或者抑制mRNA的翻译导致祀基因的转录后沉默，从而调节生物体内在的与机体生长、 发育、疾病发生过程有关的基因的表达。
[0004] 在本发明作出之前，近年来，IncRNA与肿瘤的关系已经成为研究的热点和焦点，已 经发现IncRNA通过与基因的共表达和肺癌、乳腺癌、胃癌、膜腺癌等发病高度相关。研究已 经证实血清/血浆中存在着几百种IncRNAs，运些长链分子性质稳定，含量丰富且不会降解， 易于定量检测，并存在着显著的疾病特异性。血清/血浆IncRNA作为肿瘤诊断和预后分子标 志物不仅创伤小，方法便捷，还能改进疾病诊断，肿瘤分类，预后估计、疗效及复发预测的准 确度。但是，血清/血浆IncRNA的表达量还是相对较低，若无标准化试剂盒的规范化步骤，血 清/血浆IncRNA不易检出，失去早期诊断的可能；另一方面，仅采用一种血清/血浆IncRNA作 为肿瘤标志物往往特异性不足，因仅采用一种血清/血浆IncRNA作为肿瘤标志物试剂盒敏 感度和特异度均较低，从而导致早期胃癌诊断的错诊率和漏诊率大大增加。没有用于早期 胃癌患者血清学诊断的较为稳定的生物标志物，就不能筛选出胃癌异常表达的血清/血浆 IncRNAs作为生物标志物，并研制相应的诊断试剂盒。
【发明内容】
[000引本发明的目的就在于克服上述缺陷，提出一种与胃癌相关的血清/血浆IncRNA标 志物试剂盒。
[0006] -种与胃癌相关的血清/血浆IncRNA标志物试剂盒，其主要技术特征在于血清/血 浆IncRNA标志物为MALAT1和册TAIR的组合。
[0007] 所述该引物为MALAn和册TAIR的引物，其中MALAT1的上下游引物序列是SEQ No. 1 和沈Q No.2;册TAIR的上下游引物序列是沈Q No.3和沈Q No.4。
[000引所述该试剂盒用于检测血清/血浆中MALATl和册TAIR。
[0009] 所述该试剂盒还包括PCR反应常用的酶和试剂。
[0010] 本发明的有益效果：
[0011] 本发明提供的血清/血浆IncRNA标志物作为胃癌诊断的标志物的优越性在于：
[0012] (1)血清/血浆IncRNA是一种新型生物标志物，区别于传统生物标志物，不仅稳定、 微创、易于检测，且定量精确，将大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，该类IncRNA生物标 志物的成功开发有助于胃癌的辅助诊断，为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。
[0013] (2)血清/血浆IncRNAs试剂盒是一种系统、全面的诊断和监测试剂盒，可用于胃癌 患者的辅助诊断，有助于反映胃癌患者的疾病状态，为临床医生快速准确掌握患者病情、及 时采取更具个体化的防治方案提供支持。
[0014] (3)采用严密的设计和评价体系，本发明人采用IncRNA忍片检测W获取疾病特异 和异常表达的血清/血浆IncRNAs表达谱，并应用qRT-PCR的方法进行单个验证，采用了染料 法进行验证；W上方法和策略的应用加速和保证了血清/血浆IncRNAs生物标志物和诊断试 剂盒的应用，也为其他疾病生物标志物的研制提供方法和策略上的借鉴。
[0015] 本发明优点为通过控制年龄和性别等对疾病发展的影响因素，研究血清/血浆 IncRNA在胃癌辅助诊断的应用前景，阐述异常表达的IncRNAs生物标志物和诊断试剂盒的 研制和应用，可使胃癌的诊断更加方便易行，为临床医生快速准确掌握患者病情，为临床治 疗效果评价奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物祀标提供帮助。
【附图说明】
[0016] 图1--显不胃癌病例组和健康人对照组IncRNA的柱状不意图，其中A为胃癌病例 组和健康人对照组血清MALAT1表达图，B为胃癌病例组和健康人对照组血清册TAIR图。
[0017] 图2--显示AUC曲线（A)MALAT1(B)H0TAIR(C)联合示意图，其中，A为胃癌患者 MALAT1的AUC曲线，曲线下面积为0.8 4 9 ; B为胃癌患者HOT AIR的AUC曲线，曲线下面积为 0.752;C为胃癌患者MALAT1和册TAIR联合AUC曲线，曲线下面积为0.869。
【具体实施方式】
[0018] 本发明的技术思路是：
[0019] W标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料、临 床资料等（运些资料可用于判断疾病进展，并控制患者年龄和性别等因素对于发病的影 响），并采用RT-PCR、Rea^time PCR方法、LncRNA microarray忍片检测等。
[0020] 具体地说，本发明解决问题的技术方案包括：
[0021] (1)建立统一标准的标本库和数据库：W标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液 样本，系统收集完整的人口学资料和临床资料。
[0022] (2)血清/血浆IncRNA差异表达谱分析:选择胃癌病例、与胃癌病例年龄、性别匹配 的健康人对照，检测其血清/血浆IncRNA表达谱及含量，分析胃癌病例和健康人对照间血 清/血浆IncRNA的共性和特性，筛选差异表达IncRNAs，进行进一步单个样本验证，确定胃癌 发病相关血清/血浆IncRNAs。
[0023] (3)血清/血浆IncRNA筛查和诊断试剂盒的研制:根据胃癌病例和健康人对照的特 异血清/血浆IncRNA开发IncRNAs诊断试剂盒。
[0024] 本发明的目的是通过下列技术方案实现的：
[0025] 一种与胃癌相关的血清/血浆IncRNA标志物，该标志物为MALAT1和册TAIR的组合。
[0026] 所述的血清/血浆IncRNA标志物的引物，运些引物为：
[0027] ]^1^\1'1的引物为沈9齡.1和沈9齡.2;册了41如勺引物为沈9齡.3和沈9齡.4。
[0028] 所述的血清/血浆IncRNA标志物在制备胃癌辅助诊断试剂盒中的应用。
[0029] 所述的血清/血浆IncRNA标志物的引物在制备胃癌辅助诊断试剂盒中的应用。一 种胃癌辅助诊断试剂盒，该试剂盒用于检测血清/血浆中MALAT1和册TAIR。所述的诊断试剂 盒，该试剂盒含有血清/血浆IncRNA中MLAT1和册TAIR的引物。
[0030] 所述的诊断试剂盒，该试剂盒含有的血清/血浆IncRNA标志物的引物为：
[0031 ] MALATl的引物为沈QNo.l和沈QNo.2;册TAIR的引物为沈QNo.3和沈QNo.4。
[0032] 所述诊断试剂盒还可W包括PCR反应常用的酶和试剂，如逆转录酶，缓冲液， dNTPs，Mgc 12，DEPC水和化q酶等;还可W含有标准品和/或对照品。
[0033] 具体来说主要包括W下几个部分：
[0034] 1.研究样本的选择
[0CX3日](1)经病理学明确诊断的胃癌病例
[0036] (2)采血前未经过手术和化疗，无手术前放化疗
[0037] (3)与病例年龄、性别匹配的健康人对照
[0038] 本研究共采用6例符合标准的样本进行研究。
[0039] 2. Trizol试剂（Invi trogen，Carl sbad，CA)提取血清/血浆总RNA，按常规方法操 作。通常能得到~加曲NA/50ml血清/血浆。
[0040] 3丄ncRNA microarray忍片检测（欧易公司）
[0041 ] (1)总RNA通过逆转录反应得到cDNA样品
[0042] (2)cDNA样品进行预扩增反应
[0043] (3)预扩增产物进行LncRNA microarray忍片检测，得到IncRNA的表达谱
[0044] (4)数据分析和处理
[004引 4.Real-time RT-PCR(qRT-PCR)方法
[0046] (1)取受试者的血清/血浆总RNA，通过RNA逆转录反应得到cDNA样品
[0047] (2)设计引物
[0048] (3)加入巧光探针或染料进行PCR反应
[0049 ] (4)检测并比较胃癌病例与健康人对照血清/血浆样本中IncRNA的量的变化。
[0050] 5.诊断试剂盒制备方法
[0051 ] LncRNA microarray忍片检测方法综合确定胃癌病例和健康人对照中有拷贝差异 和表达差异，通过qRT-PCR技术筛选在胃癌病例和健康人对照中表达量和差异程度大的一 组血清/血浆IncRNA,作为胃癌辅助诊断的指标。最后筛选出的与胃癌发病有关的血清/血 浆IncRNA组成诊断试剂盒(MALAT1和册TAIR)。诊断试剂盒可W包括运些血清/血浆IncRNA 组合的引物，探针，W及化q酶，dNTP等试剂。
[0052] 6.统计分析方法
[0053] 运用X2检验（用于分类变量）或者student t检验（用于连续性变量），比较人口学 特征、组织类型和IncRNA平均表达水平在研究对象组间分布的差异。
[0054]我们在3例胃癌病例和3例健康人对照中运用LncRNA microarray忍片的研究结果 发现有5种IncRNAs与胃癌发病情况有显著关联。个体IncRNAs检测的不同表达水平 表示，其中A Ct = Cw#，我们在每一个样本提取时加入GAPDH作为参照，计算相对表达 量。对有统计学显著差异的IncRNAs在3例胃癌病例和3例对照中进行单个验证，进而观察本 研究结果的稳定程度。
[005引 W下是本发明进一步说明：
[0056] 在上述3例符合条件的胃癌病例及3例健康人对照中，两组年龄按个体精确匹配。 我们将运两组人群作为探索性样本IncRNA忍片检测获得相关结果。
[0057] 根据IncRNA忍片检测，检测到在胃癌病例组和健康人对照组的血清中存在差异表 达（Δ ACT>2)的长链非编码RNA:MALAT1、册TAIR、H19。
[005引选择在胃癌病例组和健康人对照组中CT值均小于35的IncRNA, W提高检测效率， 满足上述条件的IncRNAs包括:MALAT1，册TAIR，H19和MEG3。SYBR染料法qRT-PCR结果发现在 3例胃癌病例和3例健康人对照中，册TAIR和MLAT1在胃癌病例组和健康对照组中表达情况 存在显著性差异。多因素 Logistic回归分析结果表明，运两种IncRNAs的表达水平均与胃癌 的发病存在着显著关联，即MALAT1和册TAIR在病例组中均明显高表达。
[0059] 根据上述结果，将运两种与胃癌发病相关的IncRNAs在60例胃癌病例和60例健康 人对照中进一步的单个验证。发现血清/血