检测人类brca1和brca2基因突变的引物、试剂盒及方法
【技术领域】
[0001 ]本发明设及生物技术领域，尤其设及检测人类BRCA1和BRCA2基因突变的引物、试 剂盒及方法。
【背景技术】
[0002] 乳腺癌和卵巢癌是女性常见恶性肿瘤，一般人群中女性在其一生中罹患乳腺癌和 卵巢癌的风险分别为13%和1.5%，我国近年来乳腺癌发病率高居女性恶性肿瘤的首位，并 上的速度逐年递增（Antoniou A,Pha;ro址 PD,化rod S,et al.Average risks of breast and ovarian cancer associated with BRCAl or BRCA2 mutations detected in case series unselected for family history: A combined analysis of 22 studies.American Journal of Human Genetics 2003;72(5):1117-1130)。目前认为大多 数遗传性乳腺癌是由于基因突变引起的，其中BRCAl和BRCA2基因的突变与乳腺癌发病关系 较为密切。有研究表明，携带BRCA1或BRCA2基因致病性突变的女性在其70岁后患病风险增 加了5-30倍，分别高达75%和46%(Cao W,Wang X,Li JC.Heredi1:a;ry breast cancer in the Han Chinese population.J Epidemiol.2013;23:75-84)。
[0003] BRCAl基因定位于人类染色体17ql2-21，全长8化，含24个外显子，编码蛋白含有 1863个氨基酸残基。BRCA2基因定位于13ql2.3,由27个外显子组成，编码蛋白含有3418个氨 基酸残基。BRCAl和BRCA2基因都是肿瘤抑制基因，参与细胞周期的调控、基因转录的调节、 DNA损伤的修复及调亡等重要的细胞活动。一旦BRCAl或BRCA2基因发生致病性突变，致使其 无法正常编码合成蛋白产物或合成的蛋白产物功能缺失，其抑癌作用将会受到影响，增加 癌症发生发展的危险。
[0004] 2014版NCCN乳腺癌临床指南建议:BRCAl/2基因突变的遗传性乳腺癌高风险人群 应采取必要的预防和监控措施，对于BRCA1/2基因突变阳性的患者需考虑对侧癌变的高风 险(NCCN Clinical Practice Guidelines version 1 2014 for breast cancer)。若对于 乳腺癌/卵巢癌患者，携带BRCAl/2基因致病性突变会使多发病灶和对侧癌变的风险增加。 2014年12月，美国FDA批准抗癌新药Olapar化化y吨arza)用于治疗BRCAl或BRCA2基因突变 的卵巢癌患者。近期临床研究表明，生殖系BRCAl或BRCA2突变的多种肿瘤可W从Olapar化 治疗中得到缓解化 aufman B,化 apira-Frommer R,Schmutzler RK,et al:01apa;rib monotherapy in patients with advanced cancer and a germline BRCAl/2 mutation.J Clin Oncol 33:244-50,2015)。通过对服CAl和BRCA2基因突变的检测，可W预 测乳腺癌或卵巢癌发生发展，也可W筛选出乳腺癌、卵巢癌及其他相关恶性肿瘤的高危人 群，针对卵巢癌患者，更可W从抗癌新药Olaparib中获益。
[000引目前，检测BRCA1/2基因突变的方法有很多，主要有：巧光定量PCR技术，该技术灵 敏度高、特异性强，但每次只能检测一种类型的突变，无法完全覆盖BRCA巧邮RCA2基因全编 码区；限制小片段长度多态性分析法(RFLP法），用于检测酶切位点改变的基因，可直接判断 基因型，但是不能用于没有产生新酶切位点的基因检测，且实验操作繁琐，检测周期长，成 本高；Sanger测序法，靠近引物的序列容易测不准，且测序周期较长，操作复杂，成本昂贵， 很难满足实际应用的需要。因此，急需能够相对方便、快捷、检测周期短、针对性强、检测结 果准确可靠的检测方法。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种快速、全面准确、操作简便、成本低的检测BRCA1和 BRCA2基因全外显子及其与内含子连接区和非翻译区和启动子区突变的引物。
[0007] 为实现上述目的，本发明提供一种检测BRCA1和BRCA2基因全外显子及其与内含子 连接区和非翻译区和启动子区突变的引物对，其特征在于，所述引物对中的上游引物为上 游特异性引物，同时其5'端加上通用引物化gl;下游引物为下游特异性引物，同时其5'端加 上通用引物化g2;其中上游特异性引物如SEQ ID NO: 1，3，5，7，9-193所示;下游特异性引物 如沈9 10^:2,4,6,8，10-194所示;所述化邑1序列如沈9 10^:195所示，所述化邑2序列如 沈Q ID NO: 196所示。
[0008] 进一步，还包括新的引物对，所述新的引物对中的上游引物为带有P5序列和SEQ 10^:221-236所示序列的上游引物;下游引物为带有口7序列和569 10^:197-220所示序 列的下游引物。
[0009] 本发明的另一个方面，提供检测BRCA1和BRCA2基因全外显子及其与内含子连接区 和非翻译区和启动子区突变的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的引物对。
[0010] 本发明的另一个方面，提供检测BRCA1和BRCA2全外显子及其与内含子连接区和非 翻译区和启动子区突变的方法，其特征在于，步骤为，
[0011] 文库制备：
[001引第一步PCR扩增：W待检测样本DNA作为模板，分为8管分别进行扩增；引物为上述 所不序列；
[0013] 第二步PCR扩增：W第一步PCR扩增得到的产物为模板，引物为上述所示新的引物 对序列；
[0014] 得到的第二步PCR扩增产物处理后即为文库；
[0015] 测序与结果分析:对文库进行测序，测序的结果经过数据处理后得到检测基因的 突变情况;数据处理为测序数据的转换、质控、与参考基因组NCBI 137/化19的序列比对、突 变位点分析，通过数据处理后得到检测样本的突变信息。
[0016] 进一步，所述第一步PCR扩增的8管引物分别为:第一管的引物是SEQ ID NO: 1-30 所示序列，第二管的引物是SEQ ID NO :31-60所示序列，第Ξ管的引物是SEQ ID NO :61-80 所示序列，第四管的引物是SEQ ID NO:81-110所示序列，第五管的引物是SEQ ID NO: 111- 140所示序列，第六管的引物是SEQ ID NO:141-160所示序列，第屯管的引物是SEQ ID NO: 161-180所示序列，第八管的引物是SEQ ID NO: 181-194所示序列。
[0017] 进一步，所述第一步PCR扩增的程序是94°C预变性2分钟，94°C变性45秒、60°C退火 45秒、68°C延伸2分钟循环20次，72°C最后延伸10分钟。
[0018]进一步，所述第二步PCR扩增所用的模板进行了纯化。
[0019] 进一步，所述第二步PCR扩增的程序是94°C预变性2分钟，94°C变性45秒、60°C退火 45秒、68°C延伸2分钟循环20次，72°C最后延伸10分钟。
[0020] 进一步，所述得到的PCR扩增产物处理为在扩增产物中加入21.3化AMPure磁珠进 行吸附，体积分数80 %乙醇清洗两次后，加入30-4化L纯化水洗脱。
[0021 ] 本发明中共包含97对引物，如SEQ ID NO: 1-194所示，将97对引物分在8个管子里 面进行扩增，每个管子的引物对数介于1-20对之间，每对引物的浓度介于0.1-25PM之间。其 引物序列具体如表1所示。其中序列编号对应相应的SEQ ID NO号，即序列编号1对应的是 SEQ ID N0:1，W此类推;SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2是一对上下游引物，W此类推。
[0022] 表1 97对引物序列表
[0023]
[0030]本发明提供的用于检测BRCAl/2基因突变方法，具体原理详见图1和图2,其中图1 为第一步PCR扩增原理图，图2为第二步PCR扩增原理图。其方法包括W下步骤：
[0031 ] 根据COSMIC数据公布的人类BRCA1和BRCA2野生型基因序列，针对BRCA1和BRCA2基 因的全外显子及其与内含子连接区和非翻译区和启动子区设计特异性引物(SEQ ID N0:1- 194)，并在特异性上游引物的5'端加上通用引物化gl，在特异性下游引物的5'端加上通用 引物化邑2。
[0032] Tagl序列：ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT 沈Q ID N0:195;
[0033] Tag2序列：GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT 沈Q ID N0:196。
[0034] (1)提取检测样本的