2,3-丁二醇的生成能力得到增加的重组微生物及利用其的2,3-丁二醇的生产方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及2,3-下二醇的生成能力得到增加的重组微生物及利用其的2,3-下二 醇的生产方法。
【背景技术】
[0002] 作为具有四个碳和两个径基（-0Η)的乙醇中之一 (C也C册HCH0HC也）的2，3-下二醇 可使用作为合成橡胶制备工序的原料物质的1,3-下二締（1，3-Butadiene)、燃料添加剂及 用作溶剂的甲基乙基酬(M邸，Methyl ethyl ketone)进行化学催化剂转换（Ji et al.， Biotechnol.Adv. ,29: 351,2011)。并且，2,3-下二醇与汽油(Gasoline)混合而可适用为辛 烧助推器（octane booster),从而是产业上非常重要的中间体（Celinska et al., Biotechnol.Adv.,27:715,2009)〇
[0003] 2，3-下二醇可通过化学合成工序和微生物发酵工序来生产。但是，由于通过上述 工序生产2，3-下二醇的价格非常高，因而不生产商业性规模的2，3-下二醇。另一方面，最 近，随着与通过微生物发酵工序生产2,3-下二醇技术的飞跃发展一同，对化石原料物质的 价格急剧上升和国际环境污染的制约强化，从而对W通过微生物发酵的生物为基础的2,3- 下二醇生产的关屯、和研究开发的重要性增大。
[0004] W通过微生物发酵工序的生物为基础的2,3-下二醇的生产研究分为发酵工序最 佳化(溫度、pH、溶解氧等）和微生物开发(微生物挖掘、掌握生理学特性、突然变异、基因操 作等)领域来进行。在发酵工序最佳化方面，查明了可有效生产2,3-下二醇的溫度、pH、溶解 氧浓度等多种条件（Ji et al.,Bioresou;r.Technol.,100:3410,2009;化kashimada et al.,J.Biosci.Bioeng.,90:661,2000；Nakashimada et al.,Biotechnol.Lett.,20:1133, 1998)。但是，由于通过上述条件下的微生物发酵工序的2,3-下二醇生产的生产率 (Productivity)及收率(Yield)仍然低，实际难W直接适用于商业工序。并且，在发酵过程 中，存在与2,3-下二醇一同，生成包含乳酸的多种有机酸(Organic acids)和包含乙醇的多 种乙醇(Alcohols)等多种副产物(By-products)的缺点。
[0005] 副产物的生成不仅降低对生物原料物质的2,3-下二醇的收率，而且在从培养液回 收2,3-下二醇的过程中需要巨大的分离及纯化费用。因此，有关2,3-下二醇生产的微生物 开发研究主要向减少副产物的方向进行。代表性地，Ji等通过向野生型产酸克雷伯菌菌株 露出物理/化学突然变异方法中之一的紫外线化V)，来成功地部分抑制了作为副产物的多 种有机酸的生成(Ji et al.，Biotechnol丄ett.，30:731，2008)。与此同时，将离子束（Ion beam)方式适用于肺炎克雷伯菌菌株来增加生物质消耗速度，从而可提高2,3-下二醇的生 产(Ma et al. ,ΑρρΙ.Microbiol.Biotechnol. ,82:49,2009)。在有关通过选择性基因操作 的副产物减少的研究中，去除参与作为主要副产物中之一的乳酸化actic acid)生成的基 因（1化A)来制备的变异微生物在一般条件下表示最佳的性能。并且，还有为了减少作为副 产物的乙醇的生成而去除参与乙醇生成的基因（adhE、aldA)的例（Ji et al.， Appl .Microbiol .Biotechnol. ,85 :1751,2010)。并且，还有在乳酸菌化AB，lactic acid bacteria)中降低参与甲酸生成的酶（pyruvate-formate lyase)的活性的例（W02010/ 037114 A1)。
[0006] 本发明人确认了具有2,3-下二醇的转换能力的基因，确认抑制上述基因的活性的 重组微生物的2,3-下二醇生成能力得到增加且所生成的2,3-下二醇的消耗受到抑制，并完 成了本发明。
【发明内容】
[0007] 技术问题
[0008] 本发明的目的在于，提供2,3-下二醇的生成能力得到增加的重组微生物及利用其 的2,3-下二醇的生产方法。
[0009] 技术方案
[0010] 为了达成上述目的，本发明提供基因，上述基因对具有乙偶姻与2,3-下二醇之间 的转换活性的酶进行编码，并具有SEQ ID NO. 12的碱基序列。
[0011] 并且，本发明提供重组载体，其特征在于，包含上述基因。
[0012] 并且，本发明提供由上述基因进行编码的蛋白质。并且，本发明提供重组微生物， 其特征在于，上述蛋白质的活性受到抑制。
[0013] 并且，本发明提供2,3-下二醇的生成能力得到增加的重组微生物，具有2,3-下二 醇及乳酸生物合成途径，其特征在于，上述蛋白质的活性受到抑制。
[0014] 并且，本发明提供2,3-下二醇的生成能力得到增加的重组微生物，具有2,3-下二 醇及乳酸生物合成途径，其特征在于，具有乙偶姻与2，3-下二醇之间的转换活性，向2，3-下 二醇的转换活性低于向乙偶姻的转换活性的酶受到抑制。
[0015] 并且，本发明提供2,3-下二醇的生产方法，上述2,3-下二醇的生产方法包括:对上 述重组微生物进行培养的步骤；W及从通过上述步骤得到的培养液中回收2,3-下二醇的步 骤。
[0016] 发明的效果
[0017] 本发明的重组微生物增加2,3-下二醇的生成能力，并减少已生产的2,3-下二醇的 消耗率。并且，根据重组微生物的培养的乙偶姻积累率低。
【附图说明】
[0018] 图1表示2,3-下二醇生成菌株中的2,3-下二醇的生物合成途径（图1的(A)部分)及 消耗途径(图1的(B)部分及图1的(C)部分）。
[0019] 图2图示有关存在于产酸克雷伯菌内的2,3-下二醇合成的基因操纵子。
[0020] 图3中，为了确认有关存在于产酸克雷伯菌内的2,3-下二醇合成的基因的细胞内 功能，图示化大肠杆菌化.CO1 i JM109)表达重组载体制作过程。
[0021] 图4表示重组大肠杆菌的分批式发酵时2,3-下二醇的生成能力，图5表示乙偶姻的 生成能力（参：P服budRAB/E. col i JM109、▲:地肺udRABC/E. col i JM109、 : pBRbudRA抓/ E.coli JM109)。
[0022] 图6为在M9最少培养基中，3-下二醇作为唯一的碳源来使重组克雷伯氏菌菌 株生长的结果，图7为残留的2,3-下二醇的浓度（?:!(0 Δ1化A、^:KO AdhA AbudC、·: ΚΟ AldhA Adar.^：K0 AldhA AbudCAdar.) 〇
[0023] 图8至图11表示分批式发酵多个重组克雷伯氏菌菌株来生产2,3-下二醇的结果 (图8:Κ0 AldhA，图9:Κ0 AldhA AbudC，图 10:Κ0 AldhA Adar，图 11:Κ0 AldhA Δ budC Ad曰r)〇
【具体实施方式】
[0024] 本发明设及基因，上述基因对具有乙偶姻与2,3-下二醇之间的转换活性的酶进行 编码，并具有SEQ ID NO. 12的碱基序列。
[0025] 并且，本发明设及重组载体，其特征在于，包含上述基因。
[00%]并且，本发明设及由上述基因进行编码的蛋白质。并且，本发明设及重组微生物， 其特征在于，上述蛋白质的活性受到抑制。
[0027] 并且，本发明设及2,3-下二醇的生成能力得到增加的重组微生物，具有2,3-下二 醇及乳酸生物合成途径，其特征在于，上述蛋白质的活性受到抑制。
[0028] 并且，本发明设及2,3-下二醇的生成能力得到增加的重组微生物，具有2,3-下二 醇及乳酸生物合成途径，其特征在于，具有乙偶姻与2，3-下二醇之间的转换活性，向2，3-下 二醇的转换活性低于向乙偶姻的转换活性的酶受到抑制。
[0029] 并且，本发明设及2,3-下二醇的生产方法，上述2,3-下二醇的生产方法