降钙素原抗体的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种抗体的制备方法，特别是涉及一种降钙素原抗体的制备方法。
【背景技术】
[0002] 降钙素原（procalcitonin, PCT)是一种糖蛋白质，来自定位于第11号染色体上 (11ρ15, 4)的单拷贝基因。PCT是血清降钙素（CT)的前肽物质，PCT前体在内源多肽酶作 用下剪掉nPro-CT端单一序列，生成116个氨基酸的PCT，分子量约为13kD。其分子结构为 含57个氨基酸的N末端（N-ProCT)、含32个氨基酸CT (Cakitonin)和含21个氨基酸钙抑 肽（Katacalcin)组成。在正常生理情况下，PCT是由甲状腺合成与分泌的，其在健康人体的 血浆中的含量非常低（小于〇. lng/ml)，但是PCT蛋白在体内的稳定性很好，半衰期大约为 20-241UPCT在人体感染时受内毒素、TNF-α等细胞因子影响在多种组织均可产生，当严重 细菌、脓毒症、多脏器功能衰竭时其在血浆中的水平升高，自身免疫、过敏和病毒感染时PCT 不会升高，PCT反映了全身炎症反应的活跃程度。PCT已被认为是一种用于细菌感染早期诊 断、鉴别诊断及治疗监控的最新特异性指标。因此，PCT的检测在临床诊断上有着重要的价 值。
[0003] 目前，临床上对于PCT的检测主要采用免疫学的方法，包括胶体金免疫层析、酶免 法、免疫荧光法、免疫化学发光、放射免疫分析法等。而采用这些方法最关键的是获得好用 的PCT抗体。由于PCT在正常人血清中含量很低（〈0. lng/ml)，临床上的诊断界值一般为 0. 5ng/ml。因此对诊断用的PCT抗体，除了特异性要好外，对亲和力要求也非常高。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是提供一种降钙素原抗体的制备方法，其可以获得特 异性好、亲和力高的单克隆抗体。
[0005] 本发明是通过下述技术方案来解决上述技术问题的：一种降钙素原抗体的制备方 法，其特征在于，其包括以下步骤： 步骤一，小鼠免疫，用降钙素原全长表达蛋白免疫小鼠； 步骤二，细胞融合，融合前7-10天复苏小鼠骨髓瘤细胞，放入二氧化碳细胞培养箱培 养； 步骤三，单克隆细胞株筛选，融合细胞培养6天后吸取原有培养液，加入20〇μ1新鲜的 HAT培养基； 步骤四，单克隆抗体制备。
[0006] 优选地，所述步骤四选用6-8周龄BLAB/c小鼠，腹腔注射0. 5ml石蜡油，1周以 后腹腔注射105_106/500μ1的9B3细胞；用注射器收集腹水，离心取上清后用GE公司的 protein Α预装柱进行纯化；最后获得纯化的降钙素原单克隆抗体。
[0007] 优选地，所述步骤二采用颈椎脱臼法处死4周龄BALB/c小鼠，按无菌操作取出小 鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞铺于96孔板。
[0008] 优选地，所述步骤三在第二天取培养上清，用ELISA法筛选阳性孔。
[0009] 优选地，所述ELISA法采用ELISA检测板，ELISA检测板制备条件：按50ng每孔的 抗原量包被，包被液为碳酸盐缓冲液，封闭液为5%的脱脂奶粉；阳性孔再次更换新鲜培养 基，培养1天后再次用ELISA法检测培养上清；选择2次检测都为阳性的孔进行第一次克隆 化培养，即通过有限稀释使96孔板平均每个孔只含有1个细胞；7天后，对克隆化培养板细 胞培养上清进行ELISA检测，选择阳性孔。
[0010] 本发明的积极进步效果在于：本发明获得特异性好、亲和力高的单克隆抗体。
【具体实施方式】
[0011] 本发明为了获得特异性好、亲和力高的单克隆抗体，首先采用的免疫抗原是已经 作为抗原制备过羊多抗，并获得了临床可用的多抗。因此本发明的抗原是验证过的抗原。另 一方面，本发明在抗体筛选过程中加入了亲和力的筛选，确保得到的抗体具有高亲和力。通 过本发明的方法最终获得了特异性好，亲和力高的PCT单克隆抗体9B3、2H5。应用本发明的 PCT单克隆抗体9B3、2H5形成双抗夹心酶免法检测50例阳性临床样本结果全部为阳性，可 以检测PCT含量为0. lng/ml的临床稀释样本。
[0012] 本发明降钙素原抗体的制备方法包括以下步骤： 步骤一，小鼠免疫，用PCT全长表达蛋白免疫6-8周龄BALB/c小鼠，具体免疫方案如下 表1所示： 表1
加强免疫结束后3天，采小鼠尾血，利用ELISA法检测小鼠血清效价。经过免疫的小鼠 血清效价大多在1: 1〇5_1: 1〇6左右，本发明选取效价高的小鼠进行下一步细胞融合。
[0013] 步骤二，细胞融合，融合前7-10天复苏小鼠骨髓瘤细胞SP2/0,确保细胞在融合时 处于对数生长期，状态良好。融合前一天取饲养细胞。采用颈椎脱白法处死4周龄BALB/c 小鼠，按无菌操作取出小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞铺于96孔板。融合当天，首先收集 上述的SP2/0细胞备用。然后无菌操作解剖小鼠取脾脏，在200目的铜网上轻轻研磨获得 脾细胞。将小鼠骨髓瘤细胞SP2/0与脾细胞以1 :3的比例混合，离心去上清，lmin内滴加 lml PEG介导融合，融合结束后以1640不完全培养基终止，最后离心去上清，加入HAT培养 基重悬，1〇〇μ1/孔铺入已有饲养细胞的96孔板，放入二氧化碳细胞培养箱培养。
[0014] 步骤三，单克隆细胞株筛选，融合细胞培养6天后吸取原有培养液，加入20〇μ1新 鲜的HAT培养基。第二天取培养上清，用ELISA法筛选阳性孔。ELISA法采用ELISA检测 板，ELISA检测板制备条件：按50ng每孔的抗原量包被，包被液为碳酸盐缓冲液，封闭液为 5%的脱脂奶粉；阳性孔再次更换新鲜培养基，培养1天后再次用ELISA法检测培养上清；选 择2次检测都为阳性的孔进行第一次克隆化培养，即通过有限稀释使96孔板平均每个孔只 含有1个细胞；7天后，对克隆化培养板细胞培养上清进行ELISA检测，选择阳性孔。将阳 性孔的培养上清再进行亲和力筛选，具体方法：将抗原包被ELISA检测板，细胞培养上清先 与抗原孵育lh，培养上清中的抗体会与游离抗原结合，然后将孵育后的培养上清加入到抗 原包被的ELISA检测板，培养上清中未结合的游离抗体会与ELISA检测板上包被抗原结合 而留在板上。最后加入酶标二抗显色，结果为阳性说明有抗体与包被抗原结合，阳性值