抗甲型流感病毒核蛋白的重组抗体及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及免疫检测领域，尤其是涉及一种抗甲型流感病毒核蛋白的重组抗体及 其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 流感病毒属正粘病毒科，系RNA病毒。病毒内部的核心由单链核糖核酸及核蛋白 (NP)组成，根据核蛋白的抗原性不同可分为A(甲）、B(乙）、C(丙)三型，每型又可区分为不同 亚型。甲型变异较快，每2年~3年可发生一次，乙型变异较慢。当抗原发生较大的变异时，与 前次流行株完全不同，是抗原的质变，称为抗原株变，此时产生了新的亚型。由于人群对新 的亚型缺乏抗体，因此常可引起大的流行。
[0003] 病毒的核蛋白（NP)是保守的结构蛋白，在病毒进化过程中变异率很低。同样，对流 感病毒NP的研究也已经证明了其结构的保守性。目前多种RNA病毒(如新城疫病毒，狂犬病 毒，水疱性口炎病毒，麻疹病毒等)的核蛋白都已作为抗原用于ELISA诊断试剂盒中。抗甲型 流感病毒核蛋白的重组抗体可用于分析抗原的细微结构及检验抗原抗体未知的结构关系 生产出针对复杂生物混合物中的特定分子的抗体，可用于分离、分析及纯化该特定分子抗 原;其试剂可用于临床诊断和治疗。
[0004] 长期以来，鼠源性的抗甲型流感病毒核蛋白的重组抗体被广泛的应用于科研、临 床诊断和治疗，但是在检测过程中使用鼠源性的抗甲型流感病毒核蛋白的重组抗体也存在 一些弊端，特别是在双抗体夹心法的检测试剂中同时使用两个鼠源性单抗的时候，很容易 出现假阳，导致这些假阳的原因很多，也很难分析，例如血液样本中有可能存在HAMA效应， 而在一些咽拭子或鼻拭子样本中也有可能存在一些能跟鼠抗结合的成分，所以如何能避开 两个抗体都是鼠源性的情况，这类问题就能很好的解决，而目前重组抗体工程里面对抗体 的人源化改造已经相当成熟，同时人源化改造的抗体还具有可以用于预防和治疗的潜能， 因此，对鼠源性抗体进行人源化改造是非常必要的。
【发明内容】
[0005] 基于此，有必要提供一种人源化改造的抗甲型流感病毒核蛋白的重组抗体及其制 备方法和应用。
[0006] -种抗甲型流感病毒核蛋白的重组抗体，包括重组轻链和重组重链；
[0007] 所述重组轻链包括抗甲型流感病毒核蛋白的鼠源抗体的轻链可变区与人IgG2的 轻链恒定区，所述重组重链包括抗甲型流感病毒核蛋白的鼠源抗体的重链可变区与人IgG2 的重链恒定区。
[0008] -种上述的抗甲型流感病毒核蛋白的重组抗体的制备方法，包括如下步骤：
[0009] 将抗甲型流感病毒核蛋白的鼠源抗体的轻链可变区的表达片段插入到含有人 I gG2的轻链恒定区的表达基因的表达载体中，得到第一表达载体；
[0010] 将抗甲型流感病毒核蛋白的鼠源抗体的重链可变区的表达片段插入到含有人 I gG2的重链恒定区的表达基因的表达载体中，得到第二表达载体；
[0011] 将所述第一表达载体和所述第二表达载体转染到同一宿主细胞中；以及
[0012] 诱导所述宿主细胞表达并回收得到所述抗甲型流感病毒核蛋白的重组抗体。
[0013] 上述的抗甲型流感病毒核蛋白的重组抗体在制备甲型流感病毒检测试剂或甲型 流感病毒检测仪器中的应用。
[0014] -种甲型流感病毒的检测试剂盒，包括检测试纸，所述检测试纸包括上述的抗甲 型流感病毒核蛋白的重组抗体。
[0015] 这种抗甲型流感病毒核蛋白的重组抗体包括重组轻链和重组重链，重组轻链包括 抗甲型流感病毒核蛋白的鼠源抗体的轻链可变区与人IgG2的轻链恒定区，重组重链包括抗 甲型流感病毒核蛋白的鼠源抗体的重链可变区与人IgG2的重链恒定区。与传统的鼠源性抗 体相比，这种抗甲型流感病毒核蛋白的重组抗体通过人源化改造，保留了亲本抗体的识别 抗原的特异性和亲和力，而且避免了鼠源性抗体有可能存在的假阳反应性。因此，从临床诊 断应用方面来看，这种抗甲型流感病毒核蛋白的重组抗体比传统鼠源性抗体更具有应用价 值。
【附图说明】
[0016] 图1为实施例1中抗甲型流感病毒核蛋白的重组抗体的制备方法的流程图；
[0017] 图2为一实施方式的甲型流感病毒的检测试剂盒的示意图；
[0018] 图3为如图2所示的甲型流感病毒的检测试剂盒的检测试纸的正面示意图；
[0019] 图4为如图2所示的甲型流感病毒的检测试剂盒的检测试纸的纵截面示意图；
[0020] 图5为以杂交瘤细胞FLUA-1A5提取的RNA反转录后得到的CDNA为模板进行PCR得到 的产物的琼脂糖凝胶电泳，Μ为DL2000DNA Marker;
[0021] 图6为pFP-IgCK质粒的图谱；
[0022]图7为pFP-IgCH质粒的图谱；
[0023]图8为用VL和VH特异的引物扩增的VL(390bp)和V H(402bp)基因片段，Μ为 DL2000DNAMarker；
[0024]图9为重组抗体用proteinG亲和层析柱纯化时的穿透峰和吸收峰；
[0025] 图10为重组抗体纯化后SDS-PAGE分析，a为鼠源抗体，b为重组抗体，Μ为Protein Marker〇
【具体实施方式】
[0026]下面主要结合附图及具体实施例对可分泌抗B型肝炎病毒表面抗原抗甲型流感病 毒核蛋白的重组抗体的杂交瘤细胞、抗甲型流感病毒核蛋白的重组抗体及应用作进一步详 细的说明。
[0027] 一实施方式的抗甲型流感病毒核蛋白（NP蛋白）的重组抗体，包括重组轻链和重组 重链。
[0028] 重组轻链包括抗甲型流感病毒核蛋白的鼠源抗体(mAb)的轻链可变区（L链V区， Vl)与人IgG2的轻链恒定区(L链C区，CL; k链C区，Ck;等）。
[0029] 重组重链包括抗甲型流感病毒核蛋白的鼠源抗体的重链可变区（H链V区，VH)与人 IgG2的重链恒定区(Η链C区，CH)。
[0030] 其中，上述抗甲型流感病毒核蛋白的鼠源抗体由保藏号为CCTCC C2015227的杂交 瘤细胞产生，该杂交瘤细胞于2015年12月17日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地 址：中国.武汉.武汉大学，分类命名:杂交瘤细胞株FLUA-1A5。
[0031] 具体的，抗甲型流感病毒核蛋白的鼠源抗体的轻链可变区的序列如SEQ ID NO.1 所示，人IgG2的轻链恒定区的序列如SEQ ID NO.2所示。
[0032] 具体的，抗甲型流感病毒核蛋白的鼠源抗体的重链可变区的序列如SEQ ID NO.3 所示，人IgG2的重链恒定区的序列如SEQ ID NO.4所示。
[0033] 这种抗甲型流感病毒核蛋白的重组抗体包括重组轻链和重组重链，重组轻链包括 抗甲型流感病毒核蛋白的鼠源抗体的轻链可变区与人IgG2的轻链恒定区，重组重链包括抗 甲型流感病毒核蛋白的鼠源抗体的重链可变区与人IgG2的重链恒定区。与传统的鼠源性 抗体相比，这种抗甲型流感病毒核蛋白的重组抗体通过人源化改造，保留了亲本抗体的识 别抗原的特异性和亲和力，而且避免了鼠源性抗体有可能存在的假阳反应性。因此，从临床 诊断应用方面来看，这种抗甲型流感病毒核蛋白的重组抗体比传统鼠源性抗体更具有应用 价值。
[0034] 本发明还提供了如图1所示的上述抗甲型流感病毒核蛋白的重组抗体的制备方 法，包括如下步骤：
[0035] S10、将抗甲型流感病毒核蛋白的鼠源抗体的轻链可变区的表达片段插入到含有 人IgG2的轻链恒定区的表达基因的表达载体中，得到第一表达载体。
[0036] 抗甲型流感病毒核蛋白的鼠源抗体的轻链可变区的表达片段包括抗甲型流感病 毒核蛋白的鼠源抗体的信号肽（Signal Peptide，SP)序列、框架区（framework Region，FR) 序列以及互补决定区（complementary determining region，Q)R)序列（即，高变区序列）， 并且抗甲型流感病毒核蛋白的鼠源抗体的轻链可变区的表达片段预留有Xbal和Pmll双酶 切位点。
[0037] 具体的，抗甲型流感病毒核蛋白的鼠源抗体的轻链可变区的表达片段的序列如 SEQ ID N0.5所示，用于表达如SEQ ID NO. 1所示的抗甲型流感病毒核蛋白的鼠源抗体的轻 链可变区。
[0038] 抗甲型流感病毒核蛋白的鼠源抗体的轻链可变区的表达片段可以通过如下步骤 制得:从保藏号为CCTCC C2015227的杂交瘤细胞中提取RNA，用反转录试剂盒进行RT-PCR (RT-PCR使用的引物序列如SEQ ID No. 17所示），得到的RT-PCR扩增产物70°C酶失活后作为 模板，以上游引物mKF和下游引物mKR为扩增引物进行PCR，回收PCR产物，PCR产物用rTaq DNA聚合酶进行加 A反应后插入到pMD-18T载体