一种重组华支睾吸虫分泌型磷脂酶a2蛋白及其体外可溶性表达与纯化制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种重组华支睾吸虫分泌型磷脂酶A2蛋白及 其体外可溶性表达与纯化制备方法。
【背景技术】
[0002] 现有针对华支睾吸虫分泌型磷脂酶A2蛋白（亦即，CssPLA2蛋白，GenBank登录号： ABL07371.1)的表达技术只能以包涵体形式表达出无生物活性的华支睾吸虫分泌型磷脂酶 A2蛋白，由于所表达出的华支睾吸虫分泌型磷脂酶A2蛋白不具有生物活性，而不能用于进 行该蛋白的功能研究。即使进行复杂的蛋白复性技术处理后，所得蛋白的生物性活性仍然 相当低。
[0003] 例如：现有文献F.Hu et al./Molecular&Biochemical Parasitology 167(2009) 127-134以华支睾吸虫cDNA文库编号为Cs4e05的质粒为模板，应用设计的特异引物，进行 PCR扩增目的基因。将目的基因和原核表达质粒pET-28a酶切、回收、连接及转化，构建重组 质粒pET-28a-CssPLA2.将构建的重组质粒转化入BL21 (DE3)感受态细胞，将CssPLA2重组工 程菌液大量培养、IPTG诱导表达后，重组蛋白以包涵体形式表达，12%SDS-PAGE电泳显示在 分子量约34kDa处出现一明显条带。由于重组蛋白以包涵体形式表达，破菌得到的包涵体经 6M尿素变性、稀释和透析复性后，经过金属离子亲和层析柱，在不同低浓度咪唑梯度漂洗 后，用200mmol/L咪唑洗脱，获得分子量约34kDa的单一蛋白。MTT法和流式细胞仪检测了 CssPLA2蛋白刺激人肝星状细胞LX-2增殖，半定量RT-PCR检测了 CssPLA2蛋白可促进人肝星 状细胞LX-2ΙΠ 型胶原的mRNA表达上调，从而导致肝纤维化。
[0004] 至今，现有技术中尚未见能够实现华支睾吸虫分泌型磷脂酶A2蛋白可溶性表达的 技术。
【发明内容】
[0005] 为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种重组华支睾吸虫 分泌型磷脂酶A2蛋白（亦即，重组CssPLA2蛋白）及其体外可溶性表达与纯化制备方法。
[0006] 为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：
[0007] 本发明的第一方面，提供一种重组CSSPLA2蛋白，含有CSSPLA2蛋白和MBP标签蛋 白。
[0008] 优选地，所述CssPLA2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，具体为： KPRSISRDKPHAELEffSGKLSDNQTIHIWTVASKGLFGEISKPAffIQVDIRGSNSSQDAIRLIFDQEHRLRYCVFGT DTVETSVSLDDADLLTRNPIYLEHFFFTSANEFLRACKELRRASEEPAKLVRRPRTAYRANPMIMPGTLWCGKGNAA TRERTFGDEIETDMCCRTHDRCFENIQSLTSKFGYYNPSPVTISNCECDDEFLSCLENAGTEAATRVGNLYFNVFKI PCFLRRTERICTHNDESGACGQFENREDIELFRPQRFVAPYITV〇
[0009] 优选地，所述MBP标签蛋白的氨基酸序列为PMAL-C2X质粒上MBP标签蛋白编码序列 所对应的氨基酸序列。
[0010] 优选地，CSSPLA2蛋白的N端与MBP标签蛋白的C端连接。
[0011 ] 优选地，所述CssPLA2蛋白和MBP标签蛋白之间通过连接肽连接。
[0012]进一步优选地，所述连接肽的氨基酸序列为pMAL-c2x质粒上MBP标签蛋白编码序 列之后到Xbal酶切位点之前的核苷酸序列所对应的氨基酸序列。
[0013] 本发明的第二方面，提供了一种重组CssPLA2蛋白的制备方法，包括如下步骤：
[0014] (1)获得CssPLA2目的基因；
[0015] (2)构建重组质粒:将步骤（1)所得CssPLA2目的基因以及载体质粒采用相同的限 制性内切酶切割，然后进行连接，获得重组质粒；
[0016] ⑶将步骤⑵所得重组质粒导入感受态细胞，转化；
[0017] (4)筛选阳性克隆，并将正确的重组质粒转化宿主感受态细胞；
[0018] (5)诱导表达重组CSSPLA2蛋白。
[0019] 优选地，步骤⑴中，CSSPLA2目的基因的核苷酸序列如SEQIDN0.2所示，具体为：
[0020] AAACCACGGTCAATTTCAAGGGACAAGCCACATGCTGAATTGGAATGGAGTGGAAAGTTGTCAGACAATCAGACAAT TCATATATGGACAGTAGCATCGAAAGGACTATTTGGAGAGATCTCGAAACCGGCTTGGATCCAGGTTGATATCCGAG GCTCAAATTCCAGTCAAGACGCCATTCGTCTGATATTCGATCAAGAGCATCGACTCCGTTATTGTGTGTTCGGTACA GACACTGTCGAAACATCAGTCAGTCTGGACGACGCGGATTTACTGACCAGAAATCCCATCTATCTGGAGCACTTTTT TTTCACGTCGGCCAATGAATTCCTTCGAGCGTGTAAAGAGCTCCGGAGGGCGTCAGAAGAGCCGGCCAAACTGGTCC GTCGTCCGAGAACTGCCTACCGGGCTAACCCGATGATAATGCCTGGCACACTATGGTGTGGCAAAGGTAATGCTGCC ACGCGCGAACGAACATTTGGTGACGAAATCGAGACTGACATGTGCTGTCGAACTCATGACCGATGTTTTGAAAACAT CCAGAGTCTGACGAGTAAATTCGGATACTACAATCCATCGCCAGTGACGATTTCAAATTGTGAATGCGACGATGAGT TCCTCAGCTGTCTTGAAAACGCAGGAACTGAAGCAGCCACTCGAGTTGGAAACCTGTACTTCAATGTATTCAAAATT CCGTGTTTCTTGCGGCGCACCGAACGCATTTGTACCCACAATGACGAAAGCGGAGCATGTGGACAATTTGAAAATAG AGAAGATATTGAACTGTTCCGCCCGCAACGTTTTGTTGCTCCGTACATTACTGTATGA。
[0021]优选地，步骤(2)中，所述载体质粒为pMAL_c2x质粒。
[0022] 优选地，步骤(2)中，所述限制性内切酶为Xbal和Hind III。
[0023]优选地，步骤(3)中，所述感受态细胞为肠杆菌DH5a感受态细胞。
[0024]优选地，步骤(4)中，所述宿主感受态细胞为大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。
[0025]优选地，步骤(5)中，所述诱导为IPTG诱导。
[0026]本发明的第三方面，提供前述重组CssPLA2蛋白作为催化磷脂二位酰基水解酶中 的用途。
[0027]与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0028]本发明通过广泛而深入的研究，通过特殊表达方式的优化，首次实现了 CssPLA2蛋 白的可溶性表达，并制备获得了具有生物活性的重组CssPLA2蛋白。有效地克服了现有表达 技术中所存在的问题，例如现有文献F.Hu et al./Molecular&Biochemical Parasitology 167 (2009) 127-134所得的CssPLA2蛋白是包涵体，没有酶活性，即使包涵体复性后酶活性也 损失很大，本领域技术人员有重复过这个实验，结果发现包涵体复性后酶活性非常微弱，远 远低于本发明所得重组CssPLA2蛋白的活性。
【附图说明】
[0029] 图1 :CssPLA2目的基因 PCR产物琼脂糖凝胶电泳鉴定图。
[0030] 图2:重组质粒pMAL-c2X/CssPLA2的双酶切鉴定图，M1，M2:DNA标准分子量；1:空质 粒Xbal和Hindlll双酶切;2:重组质粒Xbal和Hindlll双酶切;3:CssPLA2目的基因 PCR产物。 [0031 ] 图3:重组质粒pMAL-c2X/CssPLA2在大肠埃希菌BL21/DE3的表达产物的12%SDS- PAGE电泳分析图，Μ:蛋白标准分子量；1:重组质粒pMAL-c2X/CssPLA2IPTG诱导前;2:重组质 粒 pMAL-c2X/CssPLA2IPTG 诱导后上清；3:重组质粒 pMAL-c2X/CssPLA2IPTG 诱导后沉淀；4: 树脂亲和纯化后重组CssPLA2蛋白。
[0032]图4:阴离子交换层析法纯化重组CssPLA2蛋白（即MBP-CssPLA2融合蛋白）。
[0033] 图5:12 % SDS-PAGE分析纯化重组CssPLA2蛋白的纯度。
[0034] 图6:Western blotting鉴定重组CssPLA2蛋白。
[0035] 图7:质谱(Mass spectrum)鉴定重组CssPLA2蛋白。
[0036]图8:重组CssPLA2蛋白酶活性测定图，sPLA2(分泌型磷脂酶A2)酶活检测试剂盒检 测出实施例1中所得重组CssPLA2蛋白（MBP-CssPL