一种培养栉孔扇贝担轮幼虫细胞系的培养基及方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于海洋贝类的细胞培养技术领域，具体涉及一种培养栉孔扇贝担轮幼虫 细胞系的培养基及方法。
【背景技术】
[0002] 细胞培养是生物工程中的重要手段和常用方法之一，已广泛应用于染色体分析、 细胞代谢、基因表达、免疫、癌变机制、病毒培养、分离、鉴定和药物筛选等研究领域。贝类组 织培养工作从20世纪60年代末期开始，已见报道的有牡蛎、贻贝、文蛤等十几种。国内从20 世纪80年代开始进行该领域的研究。细胞培养是否成功的关键是能否创造适宜的环境使体 外细胞能够持续增殖，目前还没有一种针对海洋贝类的细胞培养基，为了更好地使贝类细 胞生长，许多研究者对此进行了大量的添加因子等探索性研究。但由于海洋贝类细胞培养 多模仿哺乳动物细胞培养流程，培养基也是在哺乳动物细胞培养基的基础上做出改动，而 海洋贝类细胞对营养的要求与哺乳动物细胞有所差异，使得海洋贝类细胞生长和分裂缺乏 适宜的营养因子。因此，虽然经过了近半个世纪的努力，仍没有建立起海洋贝类的永生性细 胞系，其细胞培养多停留在原代培养和有限细胞系水平上。许多研究者希望通过添加因子 优化培养基来建立海洋贝类细胞系。
[0003] 另外，体外培养的细胞种类也至关重要，常见的细胞培养种类有成体组织细胞，如 鳃细胞、外套膜细胞、血细胞、心脏细胞、神经细胞等，然而成体组织细胞在体外分裂增殖能 力有限，因此并非理想的细胞培养种类来源。发育早期的胚胎或幼虫细胞通常具有更大的 有丝分裂潜能，并且细胞多处于低分化水平或者未分化的干细胞状态，这一特性使胚胎或 幼虫细胞成为细胞培养的最佳实验材料。海洋贝类是海洋生物中的重要类群，其胚胎外由 于有膜包被不易获得单细胞，因此，幼虫细胞是海洋贝类具有体外培养前景的细胞来源。栉 孔扇贝（Chlamys farreri)隶属于软体动物门（Mollusca)、瓣鲍纲（Lamellibranchia)、珍 珠贝目（Pterioida)、扇贝科(Pectinidae)、扇贝属(Pecten)，是仅产于我国北部沿海的经 济贝类，为我国北方重要的养殖品种。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种用于培养栉孔扇贝担轮幼虫细胞系的培养基及方法， 旨在解决现有技术无法实现贝类细胞传代培养的问题。
[0005] 本发明具体通过以下技术方案实现：
[0006] -种培养栉孔扇贝担轮幼虫细胞系的培养基，所述的培养基包括以下组分： 13.7g/l的L-15基础培养基、20.2g/l NaCl、0.54g/l KCl、0.60g/l CaCl2、lg/l MgS〇4、 3.9g/l MgCl2及终浓度为5 %的胎牛血清、2mmo 1/L的谷氨酰胺、1 %的栉孔扇贝卵黄提取 液、1 %的栉孔扇贝血清、l〇〇IU/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素，pH为7.2-7.4。
[0007] 本发明所述的栉孔扇贝血清通过以下方法制备：于闭壳肌中抽取栉孔扇贝血淋 巴，置于无菌容器中4°C静置过夜，次日将上清液以2000g离心10min，收集上清后分别经 0.45μπι和0.22μπι孔径的微孔滤器过滤除菌，分装后置于-20°c保存。
[0008] 本发明所述的栉孔扇贝卵黄提取液通过以下方法制备:解剖成熟期的栉孔扇贝卵 巢，置于灭菌的海水中清洗3遍，用剪刀将卵巢剪碎至乳糜状;取lml乳糜状的组织到15ml离 心管中，加入l〇ml无钙镁离子磷酸盐缓冲液；冰上超声破碎3min，功率200W;结束后静置 5min，再4°C，8000g，离心lh;收集上清液经0.45μπι、0.22μπι微孔过滤除菌后分装到1.5ml离 心管中，每管lml，封膜，冻存备用。
[0009] 所述的无钙镁离子的磷酸盐缓冲液通过以下方法配置：0.2g/l KCl、0.2g/l 1?^〇4、3(^/1、2.168/1恥2册〇4.7!120的水溶液，使用超纯水作为溶剂，调节?!1至7.2-7.4后 高压灭菌，置于4°C保存。
[0010] 本发明的另一目的在于提供一种培养栉孔扇贝担轮幼虫细胞系的方法，利用所述 培养基进行担轮幼虫的单细胞原代培养，实现早期传代并进行传代培养，具体包括以下步 骤：
[0011] 1)单细胞的获取
[0012] 取性腺成熟的栉孔扇贝，诱导配子排放、人工授精并培养到担轮幼虫，离心浓缩后 加入无钙镁离子的磷酸盐缓冲液，以解离获得担轮幼虫的单细胞；
[0013] 2)原代培养
[0014] 将获得的单细胞接种到培养皿中，加入lml上述培养基，启动原代培养；
[0015] 3)传代培养
[0016] 当原代培养的细胞长出克隆后挑取克隆，实现早期传代，待传代培养的细胞铺瓶 率达到80%时，使用机械吹打的方法以1:2的比例进行传代，完成栉孔扇贝担轮幼虫体外培 养细胞的传代培养，成功建立栉孔扇贝担轮幼虫细胞系。
[0017] 本发明的有益效果为：1)采用本发明方法构建的栉孔扇贝担轮幼虫细胞系可以进 行连续传代，目前已传代60代以上。细胞形态近圆形，核质比大，生长曲线正常，可以稳定连 续传代，冷冻保存。可以应用于海洋贝类养殖病原微生物的致病机理、细胞分子育种、功能 基因、转基因等研究领域。2)本发明研制了一种适用于海洋贝类担轮幼虫细胞培养的培养 基，确定添加低浓度的胎牛血清与扇贝血清和卵黄提取液，可有效地提高细胞的存活，可使 细胞持续增殖，并且该方法对其它海洋贝类细胞系的建立具有指导意义，应用价值极大。
【附图说明】
[0018] 图1是本发明的栉孔扇贝担轮幼虫细胞原代培养第2天的显微镜照片；
[0019] 图2是本发明的栉孔扇贝担轮幼虫细胞克隆的显微镜照片；
[0020] 图3是本发明的栉孔扇贝第10代担轮幼虫细胞的显微镜照片；
[0021] 图4是本发明的栉孔扇贝第50代担轮幼虫细胞的显微镜照片；
[0022]图5是本发明的栉孔扇贝第10代担轮幼虫细胞Giemsa染色的显微镜照片；
[0023]图6是本发明的栉孔扇贝担第45代轮幼虫细胞的生长曲线；
[0024]图7是本发明的栉孔扇贝第26代担轮幼虫细胞和鳃组织的ITS(18S与28S rRNA内 转录间隔区)PCR扩增片段。
【具体实施方式】
[0025] 下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施 例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示 的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明 的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
[0026] 实施例1栉孔扇贝担轮幼虫细胞系的构建
[0027] 1)配置培养基
[0028]栉孔扇贝血清的制备:于闭壳肌中抽取栉孔扇贝血淋巴，置于无菌容器中4°C静置 过夜，次日将上清液以2000g离心10min，收集上清后分别经0 · 45μπι和0 · 22μπι孔径的微孔滤 器过滤除菌。分装后置于-20 °C保存。
[0029] 栉孔扇贝卵黄提取液的制备:解剖成熟期的栉孔扇贝卵巢，置于灭菌的海水中清 洗3遍，用剪刀将卵巢剪碎至乳糜状。取lml乳糜状的组织到15ml离心管中，加入10ml无钙镁 离子磷酸盐缓冲液;冰上超声破碎3min(超15s停10s)，功率200W。结束后静置5min，再4°C， 8000g，离心lh;收集上清液经0.45μπι、0.22μπι微孔过滤除菌后分装到1.5ml离心管中，每管 lml，封膜，冻存备用。
[0030] 无钙镁离子的磷酸盐缓冲液的配置:0.2g/l KCl、0.2g/l KH2P〇4、30g/l、2.16g/l Na2HP〇4 · 7H20的水溶液，使用Mi 11 ipore超纯水作为溶剂，调节pH至7.2-7.4后高压灭菌，置 于4°C保存。<