一种waaR基因缺陷型细菌合成低分子量肝素前体的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种降低多糖分子量的方法，通过基因工程手段敲除细菌waaR基因， 通过多糖电泳、GPC检测验证，发现突变菌株合成的多糖分子量比改造前低，实现了在保持 多糖产量的同时进一步获得更低分子量产物的目的。 (二)
【背景技术】
[0002] 肝素(heparin)是一种含硫酸酯的粘多糖，是由二种多糖交替连接而成的多聚体， 具有抗凝血和抗血栓作用。肝素虽然广泛应用于抗凝血，但是会对人体产生一定的副作用， 例如造成出血并发症以及血小板减少等症状，这在一定程度上限制了它的应用。而低分子 量的肝素 （low molecular weight heparin，LMWH，分子量小于8000Da，平均大小为5000Da) 不仅保持了抗凝血的功能，而且产生的副作用也大大减小。由于分子量低以及多分散性程 度的下降，低分子量肝素表现出了更好的药代动力学特征，半衰期变长，生物利用率高，使 用也更安全，更重要的是大大降低了肝素药物易导致出血、血小板减少和骨质疏松等副作 用。因此，低分子量肝素已经逐渐替代传统的肝素，更广泛的应用于临床治疗，目前低分子 肝素类在肝素类药物用量比重中占了80%以上。
[0003] 从制备方法来看，低分子量肝素可以通过物理法，化学法以及酶法得到。物理分离 法是从未分级的肝素 (Unfractionated Heparin，UFH)中分离得到低分子量肝素，但是该方 法需要添加有机溶剂，会影响产物的质量。而且在UFH中，低分子量肝素含量有限，因此该方 法不适合应用于低分子量肝素的大规模生产。利用过氧化氢和亚硝酸化学解聚生产低分子 量肝素已经广泛应用于工业生产，但是仍然存在很多缺点，例如造成环境污染，过程不易控 制，氧化剂与heparin分子硫酸基团之间的剧烈反应会造成低分子量肝素药用活性的降低 等。Escherchia.coli K5的荚膜多糖中有结构为(-GlcUA-l，4-GlcNAc-l，4-)n，其二糖骨架 结构与脊椎动物中的肝素类似，但未硫酸化，也没有将葡糖醛酸异构化为艾杜糖醛酸，故又 称为肝素前体(heparosanhigg〗年，Nielesen等应用肝素酶I解聚高分子量肝素成功制得 LMWH，证明了应用酶法制备低分子量肝素的可行性。相对于化学法，酶法具有反应条件温 和，特异性强，环境友好型等优点，目前酶法制备仍处于实验室研究阶段，但以heparosan为 合成前体进行化学或酶法修饰得到特定功能肝素及其衍生物是越来越受到关注。通过不同 的解聚方法制成的不同品种的低分子肝素，其药物动力学特性和抗凝谱有不同程度的差 另IJ，在临床上不能相互代替。目前，已开发出十几种低分子肝素产品，如已在临床应用的依 诺肝素钠、达肝素钠、那曲肝素钙、舍托肝素钠、亭扎肝素钠、瑞肝素钠等。
[0004] 大肠杆菌细胞表面有脂多糖，肠杆菌共同抗原以及荚膜多糖或者K抗原。这些多糖 分子之间相互作用，共同维持细胞表面多糖组织结构的稳定。waaR基因编码α-1，2_糖基转 移酶，能够将第三个葡萄糖残基(GLcIII)添加到外核。waaR基因功能缺失的突变株合成的 外核将缺失GicIII和HepIV末端残基片段，影响脂多糖结构的稳定。E.coli K5多糖通过其 还原端的脂质替代物与外膜磷脂酸分子结合连接于细胞表面。磷酸二酯键的不稳定会导致 heparosan从细胞表面脱落，富集于培养基中。目前已有研究证明waaR基因的缺失不会影响 E. coli K5多糖的合成，但对于具体缺失后是否会对其多糖产量和多糖物质结构变化的深 入研究未有相关报道。 (三)
【发明内容】
[0005] 本发明目的是提供一种waaR基因缺陷型细菌合成低分子量肝素前体的方法，即利 用Escherichia coli K5 AwaaR制备低分子量heparosan的方法，实现保存多糖产能而降 低了目的多糖平均分子量。
[0006] 本发明采用的技术方案是：
[0007] 本发明提供一种waaR基因缺陷型细菌合成低分子量肝素前体的方法，所述方法为 敲除产荚膜多糖细菌waaR基因，获得细菌突变株;将细菌突变株经发酵培养，取培养液分离 纯化，得到降低分子量的多糖(即肝素前体）。
[0008] 进一步，所述waaR基因的核苷酸序列为SEQ ID NO. 1所示。
[0009] 进一步，所述细菌为大肠杆菌，优选为E.coli K5。
[0010] 进一步，所述敲除产荚膜多糖细菌waaR基因的方法为:将质粒PKD46电转入细菌细 胞(优选E.coli K5)，在含50-100yg/mL(优选100yg/mL)氨苄青霉素的LB平板上筛选阳性克 隆，获得含PKD46的细菌细胞；以质粒pKD4为模板，在引物PI、P2作用下，PCR合成两端为waaR 基因同源臂，中间为抗性标记的打靶片段，获得打靶DNA;将打靶DNA与含pKD46的细菌感受 态细胞进行电转化，并在含50-100yg/mL(优选100yg/mL)卡那霉素的LB平板上进行抗性筛 选，获得敲除waaR基因的细菌突变株；
[0011] P1：
[0012] TTATTTACGGTAATATTTTCGGCAAAGATAACACACTCCTGCAATGAGTCCTGAGAATGGGAATTAGCCATGGTCC；
[0013] P2：
[0014] GTGGACTCATTTCCTGCCATAGAGATAGATAAAGTTAAAGCCTGGGATTTTAGGCTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC〇
[0015] 进一步，所述发酵培养方法为:将细菌突变株接种至发酵培养基，在30-37 °C、120-200rpm培养24-33小时（优选37°C、200rpm培养24小时），发酵结束后将发酵液在8000-lOOOOrpm离心10-30min(优选lOOOOrpm离心30min)，弃去菌体，得发酵上清液，将发酵上清 液分离提取，获得降低分子量的肝素前体;所述发酵培养基:十二水合磷酸氢二钠 l〇-25g/ L，磷酸氢二钾 0 · 2-2g/L，氯化铵 2-6g/L，葡萄糖 10-30g/L，盐酸硫胺素 5-100mg/L，5-20mL/L 痕量元素，pH 7.0~7.2，溶剂为水(优选去离子水）；痕量元素组成为:七水合硫酸亚铁2-20g/L，氯化钙0.2-4g/L，七水合硫酸锌0.2-10g/L，四水合硫酸锰0. l-2g/L，五水合硫酸铜 0.2-2.0g/L，四水合钼酸铵0-0.2g/L，十水合四硼酸钠 0-0.2g/L，溶剂为5mol/L HC1水溶 液;优选所述发酵培养基终浓度组成为:十二水合磷酸氢二钠 22.60g/L，磷酸氢二钾0.45g/ L，氯化铵4g/L，葡萄糖20g/L，盐酸硫胺素10mg/L，10 · 0mL/L痕量元素 ，pH 7 · 0~7 · 2，溶剂为 水;痕量元素组成为:七水合硫酸亚铁10. 〇g/L，氯化钙2.0g/L，七水合硫酸锌2.2g/L，四水 合硫酸锰0.5g/L，五水合硫酸铜1.0g/L，四水合钼酸铵0. lg/L，十水合四硼酸钠0.02g/L，溶 剂为5mol/L HC1水溶液。
[0016] 进一步，所述发酵上清液分离纯化的方法为:将发酵上清液用体积浓度1.0-2.0 % (优选1.5% )的过氧化氢水溶液脱色，4-25°C (优选4°C)过夜后，离心去除沉淀，取上清用质 量浓度50-70% (优选65% )饱和硫酸铵进行发酵液盐析，4-25°C (优选4°C )存放过夜;次日 8000-10000rpm，10-30min(优选 10000rpm，30min)离心，沉淀物用200-3000Da(优选500Da) 透析袋进行透析脱盐，浓缩并冻干，获得降低分子量的肝素前体。
[0017] 本发明的有益效果主要体现在:本发明提供了一种通过基因工程手段改造产荚膜 多糖细菌，以获得更低分子量的肝素前体，该方法可适用于E.coli，所述方法为敲除产荚膜 多糖细菌waaR基因，突变菌株进行发酵培养，保持多糖产能而降低了目的多糖平均分子量。 (四）
【附图说明】
[0018] 图1为突变菌株PCR验证，泳道1为E.coli K5出发菌株的PCR产物，泳道2为E.coli K5 Δ WaaR(简称为E. coli KT)突变菌株的PCR产物，泳道3为Marker。
[0019] 图2为E.coli K5(A)和突变菌株E.coli KT(B)的电镜图。
[0020] 图3为E.coli K5菌株和突变菌株E.coli KT发酵情况的比较图。
[0021]图4为多糖PAGE图谱，1为突变菌株0.6mg/mL E.coli KT多糖样品；2&3分别为 0.5mg/mL和lmg/mL E.coli K5多糖样品；4为2mg/mL Heparin Sodium;5为lmg/mL Heparin Sodium 样品。
[0022] 图5为E.coli K5多糖GPC分子量分布图。
[0023] 图6为E.coli KT多糖GPC分子量分布图。 (五)
【具体实施方式】
[0024]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0025] 实施例l:E.coli K5 waaR基因敲除
[0026] 按照说明书(E.Z.N.A.TM Bacterial DNA Kit)进行E.coli K5基因组提取。根据 NCBI上提交的E · coli strain F632waaR基因（GenBank: AF019375 · 1)以及该基因的附近碱 基序列，分别从离该基因上游65bp和下游58bp处设计引物WY1和WY2用于扩增E.coli K5 waaR基因，并使该基因两端带有额外碱基序列，以用于测序。以E.coli K5基因组为模板，在 引物WY1和WY2作用下，PCR扩增获得E.coli K5 waaR基因 （SEQ ID N0.1所示）。设计敲除引 物P1和P2用于扩增卡那霉素抗性基因（加有下划线的序列为同源臂，小写字母为扩增pKD4 上kan基因的引物），并使扩增片段两侧带有56bp的waaR基因同源臂。
[0027] 按照说明进行质粒pKD46与质粒pKD4提取（E.Z.N.ATM Plasmid Mini Kit， OMEGA)，用电转化仪（Gene Pulser Xcell，BI〇-RAD)将质粒pKD46转入E.coli K5,进行 E · coli K5/pKD46的制备（电转化参数2500V，25yF，200 Ω )，l〇〇yg/mL氨苄青霉素的LB平板 上进行抗性筛选。以质粒PKD4为模板，在引物P1、P2的作用下，PCR合成含有两端waaR基因同 源臂，中间为抗性标记的打靶片段，以制备打靶DNA，与E.coli K5/pKD46感受态细胞进行电 转化（电转化参数2500V，25yF，200 Ω )，并在lOOyg/mL卡那霉素的LB平板上进行抗性筛选， 获得敲除waaR基因的E.coli K5突变株E.coli KT。
[0028] 打靶DNA PCR合成体系为：5XPrimeSTAR Buffer 10yL，dNTP mixture 4yL，Pi和P2 各 1.50yL，模板0.40yL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.60yL，用灭菌蒸馈水补足至50μ L〇
[0029] 打靶DNA PCR合成条件为：
[0030] Step 1:95 °C5min;
[0031] Step 2：94〇C50s,65〇C45s(-0.5〇C,R=3.0°/s,touch down65-55〇C), 72〇C90s, 20 个循环；
[0032] Step 3:94。〇5〇8,551€458,721€9〇8,