进行细胞培养：将实施 例1中所得的卟啉光敏剂配成浓度为10 μ M/1的水溶液，将海拉细胞（细胞密度为5 X 103 个/孔，150 μ 1/孔）种植在96孔板中24h，然后将卟啉光敏剂水溶液加入到种植好的细胞 中培养4小时。然后杀死细胞，选用商业细胞核染料一H 〇echst33258对上述培养细胞的细 胞核进行标记，然后利用激光共聚焦进行测试，结果如图分别如图4、图5和图6所示。
[0123] 将上述图4、图5和图6进行叠加，获得图7。
[0124] 由图4、图6以及与图7对比可以得知，由本发明提供的制备方法得到的卟啉光敏 剂和商业细胞核染料的成像位置、形态和数量一致，以及将图4与图5对比可以得出，叶啉 光敏剂具有在细胞核上成像的功能。
[0125] 光动力治疗特性测试
[0126] -、将实施例1中所得的卟啉光敏剂与海拉细胞采用下述方法进行细胞培养：将 实施例1中所得的卟啉光敏剂配成两组浓度均为10 μ M/1的水溶液，再将两组海拉细胞 (每组细胞密度均为5 X 103个/孔，150 μ 1/孔）分别种植在96孔板中并培养24h，两组培 养细胞中均加入配制好的卟啉光敏剂水溶液培养4小时，然后用PBS缓冲液洗去未进入细 胞的光敏剂。选择其中一组培养好的细胞在365nm紫外光下照射10分钟，然后两组培养细 胞均继续培养48小时。
[0127] 通过激光共聚焦显微镜对紫外光作用前和紫外光作用后的培养细胞进行测试，结 果分别如图8和图9所示。
[0128] 由图8、图9可以得出：由本发明提供的制备方法得到的卟啉光敏剂在紫外光的作 用下，能够产生对细胞有毒的单线态氧，从而具备杀死癌细胞的功能，且具有较强的杀死细 胞的能力。
[0129] 二、分别完成下述两组实验：
[0130] 1)将实施例71中所得光敏剂分别配成0. 01μΜ/1、0. 1μΜ/1、1μΜ/1、5μΜ/1、 10 μ M/1、20 μ M/1、50 μ M/1和100 μ M/1的水溶液，然后将八组海拉细胞（每组细胞密度均 为5X103个/孔，150 μ 1/孔）分别种植在96孔板中并培养24h，将上述不同浓度的光敏 剂水溶液分别加入到每组种植好的海拉细胞中培养4小时后，用PBS缓冲液洗去未进入细 胞的光敏剂，然后继续培养48小时。
[0131] 2)将实施例1中所得光敏剂再次分别配成0. 01μΜ/1、0. 1μΜ/1、1μΜ/1、5μΜ/1、 10 μ M/1、20 μ M/1、50 μ M/1和100 μ M/1的水溶液，然后将八组海拉细胞（每组细胞密度为 5X 103个/孔，150 μ 1/孔）分别种植在96孔板中24h，将上述不同浓度的光敏剂水溶液分 别加入到每组种植好的海拉细胞中，4小时后，将各组培养好的细胞在365nm紫外光下照射 10分钟后，继续培养48小时。
[0132] 最后通过采用磺基罗丹明B染色法（sulforhodamine B，SRB)对紫外光照射前后 的培养细胞的细胞存活率进行测试，结果如图10所示。
[0133] 其中，细胞存活率可用下列公式计算：
[0134] 细胞存活率％= (A540nm处被处理后的细胞/A540nm处控制细胞数）X100%，其 中A540nm为染色后细胞在540nm处的吸收值。重复三次实验取平均值，IC 5。值以卟啉光敏 剂聚集体浓度（μΜ)表示。
[0135] 由图10可以得出：由本发明提供的制备方法得到的卟啉光敏剂在没有紫外光的 刺激时，对细胞是无毒害的，基本不影响细胞存活率，而经过紫外光作用后，光敏剂产生对 细胞有害的单线态氧，使细胞存活率大幅下降，因此卟啉光敏剂在紫外光作用下，具备较强 的杀死细胞的能力。
[0136] 以上结合【具体实施方式】和范例性实例对本发明进行了详细说明，不过这些说明并 不能理解为对本发明的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本发明精神和范围的情况下， 可以对本发明技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本发明 的范围内。本发明的保护范围以所附权利要求为准。
【主权项】
1. 一种具有可视化光动力治疗特性的卟啉光敏剂的制备方法，该方法包括以下步骤： 1) 将水溶性卟啉和可溶性硝酸盐加入到水中，混合均匀，其中，水溶性卟啉可由式I所 示：其中，R为极性基团，优选为磺酸基芳烃基、N-烷基吡啶基及其衍生物基团如N-烷基苯 并吡啶基、氨基芳烃基、季铵基芳烃基或羧基芳烃基； 2) 将步骤1)中的体系的pH调至酸性； 3) 在室温和避光条件下，将步骤2)中调节pH后的体系静置，获得包含有卟啉光敏剂的 反应体系。2. 根据权利要求1所述的制备方法，其中，在步骤1)中， 当R为磺酸基芳经基时，R选自下述结构式中的一种：其中，Χ 为 Cl、Me、OMe 或 F; 当R为N-烷基吡啶基及其衍生物基团时，R选自下述结构式中的一种：当R为氨基芳经基时，R选自下述结构式中的一种： '(?，. 当R为季铵基芳经基时，R选自下述结构式中的一种：当R为羧基芳经基时，R选自下述结构式中的一种：3. 根据权利要求1或2所述的制备方法，其中，在所述步骤1)中， 所述基团R为磺酸基芳烃基或羧基芳烃基，优选为磺酸基芳烃基， 所述基团R更优选为下述结构式中的一种：所述基团R最优选为下述结构式中的一种：4. 根据权利要求1~3中任一项所述的制备方法，其中，在所述步骤1)中， 所述可溶性硝酸盐为硝酸钠、硝酸铅、硝酸钡、硝酸锌、硝酸镉、硝酸钾、硝酸钙、硝酸 铈、硝酸铬、硝酸铋、硝酸镍、硝酸银、硝酸钯、硝酸钼、硝酸铱和镧系金属硝酸盐中的一种或 多种， 所述可溶性硝酸盐优选为硝酸钠、硝酸钙、硝酸锌、硝酸铬、硝酸镉、硝酸铋、硝酸镍和 硝酸铒中的一种或多种， 所述可溶性硝酸盐更优选为硝酸钠、硝酸铋、硝酸铬和硝酸铒中的一种或多种。5. 根据权利要求1~4中任一项所述的制备方法，其中，在所述步骤2)中， 选用无机酸将步骤1)中的体系的pH调至0. 1~5,所述无机酸为盐酸、硫酸、磷酸、硝 酸、碘酸、硼酸、碳酸、偏磷酸、焦磷酸、次磷酸、硅酸和氢溴酸中的一种或多种，尤其是盐酸、 硫酸、硝酸、磷酸和碳酸中的一种或多种，优选为盐酸、硝酸和硫酸中的一种或多种。6. 根据权利要求1~5中任一项所述的制备方法，其中，在所述步骤2)中， 将体系的pH值调节至1. 0~4,优选为2~3。7. 根据权利要求1~6中任一项所述的制备方法，其中，在所述步骤1)中， 所述水溶性卟啉和可溶性硝酸盐的摩尔比为水溶性卟啉：可溶性硝酸盐=1 :(〇. 1~ 25)，优选1 : (0· 5~10)，更优选为1 : (1~8)，最优选为1 : (1. 2~4)。8. 根据权利要求1~7中任一项所述的制备方法，其中，在所述步骤3)中， 静置时间至少为6小时，优选至少为12小时，更优选至少为18小时，最优选至少为24 小时，和/或 将步骤3)中获得的含有卟啉光敏剂的体系经过离心得到沉淀，然后对沉淀依次用去 尚子水洗涤、冻干。9. 由权利要求1~8中任一项所述的方法制得的卟啉光敏剂，为一种纳米聚集体，其尺 寸为200~500nm。10. 由权利要求1~8中任一项所述的制备方法得到的卟啉光敏剂在光动力治疗方面 的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种具有可视化光动力治疗特性的卟啉光敏剂的制备方法，该方法通过将水溶性卟啉分子与可溶性硝酸盐在酸性、避光以及室温的条件下进行反应，得到包含有卟啉光敏剂的反应体系，该体系经过处理后，得到卟啉光敏剂，为一种纳米聚集体，具有细胞成像和光动力治疗特性。此外，由本发明提供的制备方法工艺简单，无需复杂的合成步骤以及后处理步骤，易于操作，成本较为低廉，因此，易于生产上的推广。
【IPC分类】A61K49/00, A61K41/00, C07D487/22, A61P35/00
【公开号】CN105622620
【申请号】CN201410602362
【发明人】黄建滨, 赵蔷, 阎云
【申请人】北京大学
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2014年10月31日