一种制备卡贝缩宫素的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种固液相结合合成多肽的方法，尤其是卡贝缩宫素的制备方法。
【背景技术】
[0002] 预防宫缩乏力产后出血除了按摩子宫外，主要使用收缩子宫的药物。宫缩剂常用 缩宫素、麦角新碱、前列腺素制剂，各种药物均有其优点及缺点。缩宫素使用最广泛，优点是 起效快，安全、副反应小，缺点是作用时间短，半衰期为卜6 min，其作用的发挥依赖于体内 的缩宫素受体，当受体饱和后，无限制加大用量反而效果不佳，并出现副反应，24 h总量应 控制在60 u内。因为以上原因，催产素有时作用有限。麦角新碱对子宫体、子宫下段及子宫 颈均有收缩作用，可引起全子宫强直性收缩，但收缩子宫的同时可使血管平滑肌收缩，可引 起血压升高，禁用于心血管疾病，国内目前断货。常用前列腺素制剂有米索前列醇和卡前列 素氨丁三醇:米索前列醇系前列腺素 E1的衍生物，可引起全子宫有力收缩，但副反应较大， 恶心、呕吐、腹泻、寒战和体温升高较常见;青光眼、哮喘及过敏体质者禁用。卡前列素氨丁 三醇(商品名：欣母沛）：为前列腺素 F2ct衍生物（15-甲基FGF2a)，也可引起全子宫协调有力 的收缩，作用效果较明显，单剂量注射后作用持续15~30 min。副反应较米索前醇轻，但价格 较昂贵，目前约600元1支，价格限制了它的广泛应有，目前主要用于难治性产后出血。
[0003] 卡贝缩宫素是一种合成的具有激动剂性质的长效催产素九肽类似物，它的临床和 药理特性与天然产生的催产素类似，引起子宫的节律性收缩，在原有的收缩基础上，增加其 频率和增加子宫张力。卡贝缩宫素对非妊娠的子宫没有作用，仅对妊娠子宫和刚生产的子 宫具有有效的子宫收缩作用。静脉推注后子宫迅速收缩，可在2 min内达到一个明确强度， 半衰期为40 min，明显长于缩宫素。本研究显示，卡贝缩宫素组产后2 h出血量和产后24 h 出血量明显少于缩宫素组，产后出血率低于缩宫素组，与国内其他研究相符。卡贝缩宫素疗 效高于缩宫素的最主要原因是其作用时间长，产后2 h是产妇最容易出血的时间，缩宫素由 于其半衰期短，作用时间也短，而单剂量静脉注射100 yg卡贝缩宫素对子宫的活性作用可 持续1 h以上，明显长于普通缩宫素，故作用效果更好。由于其作用时间长，除少数对缩宫素 不敏感者，很少需要再加用其他药物，有研究表明，在剖官产分娩后降低产后出血发生率方 面，单次静脉给药1〇〇 yg至少与连续16 h静脉滴注催产素的效果相当。
[0004] 在副作用方面，使用卡贝缩宫素少数可见恶心、呕吐、腹痛、瘙痒、面红、低血压、头 痛、口腔金属味，但程度很轻，无需处理。本研究每个病例仅使用1支，未见严重副反应病例， 重复使用有待进一步研究。目前卡贝缩宫素市场价格约320元，较欣母沛低，患者容易接受。 综上所述，卡贝缩宫素具有高效、安全、实用的优点，值得临床推广。
[0005] 卡贝缩宫素分子结构 1? \J\ I N μ J n -?Η α μ J I|J'J l±l \ ' r
η ΠΑ? μ ZX.^1 η μ=?) /| μ I|J'J |dt| yj J-v ? 式步骤多，要求合成人员经验丰富，每步骤纯化能力强，同时耗时耗力，不利于多肽的大规 模生产。
[0006] 在较为近期的中国专利（公开号CN101555272A)公开了一种卡贝缩宫素的固相制 备方法，较为先进，但是仍有不足：1，收率低，专利公开收率为45%，一般收率可达30%较为正 常;2，纯化成本高，液相填充柱本身价格很贵，利用高效液相色谱洗脱也要用大量的乙腈和 水冲洗;造成收率低的根本原因一方面是因为含卤化合物缩合后切割过程中即与分子内或 者分子间的其他基团反应生成杂质，另一方面是因为在液相色谱柱中由于杂质相近而导致 纯化过程中损耗过大。
[0007] 本发明提前将卤化物和巯基反应，反应完后将卤代物清洗干净有效的避免了副反 应，采用高效逆流色谱分离进行无损分离，大大提高收率和操作方便度。
【发明内容】
[0008] 为提高卡贝缩宫素的合成收率，提高合成质量，本发明公开了一种方便快捷，易于 大规模生产的卡贝缩宫素制备方法，主要解决现有制备方法存在的收率低、纯化成本高的 技术问题。
[0009] -种制备卡贝缩宫素的方法，包括以下步骤：1)由氨基树脂通过偶联剂依次与 Fmoc-Gly-〇H、Fmoc-Leu-〇H、Fmoc-Pr〇-〇H、Fmoc-Cys(Alloc)-〇H、Fmoc-Asn(Trt)-〇H、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fm 〇C-Ile-OH偶联得到树脂多肽;2)脱半胱氨酸保护;3)碱性条件下与4-卤基 丁酸反应，与H-Tyr(0Me)-0tBu偶联;4)切割多肽，液相关环;5)粗肽经高效逆流色谱纯化， 冻干得到卡贝缩宫素。
[0010] 所用氨基树脂为Rink amide树脂，替代度为0.4mmol/g~1.2mmol/g。
[0011] 所用偶联试剂为 DIC/H0Bt、DIC/H0At、PyB0P/H0Bt、TBTU/H0Bt、HBTU/H0BtSHATU/ HOAt中的一种。
[0012]脱除半胱氨酸加保护试剂，为四三苯基膦钯，苯硅烷和二氯甲烷混合溶剂（四三苯 基膦钯为树脂多肽物质的量的3%，苯硅烷:二氯甲烷体积比=1: (10~20))，4_卤代丁酸为4-溴丁酸或4-氯丁酸。
[0013] 步骤3)具体为，将脱巯基保护剂的树脂多肽转移至三口烧瓶中，氮气保护，加入 DMF溶剂，加入1.5~5倍量(脱巯基保护剂的树脂多肽物质量为基准)有机碱N-甲基吗啉，开 启搅拌，冰浴，滴加1.1~4倍量(脱巯基保护剂的树脂多肽物质量为基准)4_卤代丁酸DMF溶 液，反应0.1~2小时，过滤，DMF和甲醇轮换洗涤;与H-Tyr (OMe) -OtBu偶联，偶联剂采用前述 偶联剂。
[0014] 步骤4 )具体为：先由哌啶溶液脱Fmoc保护基，再用TFA溶液将多肽切割保护基脱 除，离心，倾出溶液，粗肽溶于DCM，冰浴加 HOSu，与DCC环合，滤出固体，低温旋干DCM，正丁醇 溶解多肽，稀碳酸氢钠溶液洗涤得，卡贝缩宫素粗肽正丁醇溶液。
[0015] 纯化方法采用高效逆流色谱，萃取剂为甲醇：正丁醇：水:醋酸体积比=(1~4) : (1~ 6): (1~5): (0.01~1)，根据高效色谱液相质谱确定出峰时间，收集卡贝缩宫素醋酸盐纯肽混 合溶液，乙醚萃取洗掉正丁醇，卡贝缩宫素醋酸盐纯肽水溶液冻干，得卡贝缩宫素产品。
[0016] 高速逆流色谱（high-speed countercurrent chromatography，HSCCC )是 20世纪80年代发展起来的一种连续高效的液-液分配色谱分离技术，它不用任何固态 的支撑物或载体。它利用两相溶剂体系在高速旋转的螺旋管内建立起一种特殊的单向性 流体动力学平衡，当其中一相作为固定相，另一相作为流动相，在连续洗脱的过程中能保留 大量固定相。由于不需要固体支撑体，物质的分离依据其在两相中分配系数的不同而实现， 因而避免了因不可逆吸附而引起的样品损失、失活、变性等，不仅使样品能够全部回收，回 收的样品更能反映其本来的特性，特别适合于天然生物活性成分的分离。而且由于被分离 物质与液态固定相之间能够充分接触，使得样品的制备量大大提高，是一种理想的制备分 离手段。
[0017] 本发明的有益效果是:传统的多肽纯化是利用高效液相色谱法，物质在填料中的 洗脱系数分离，在操作需要大量的高纯乙腈，操作过程色谱柱的能力也有损耗，是一个昂贵 的耗材，并且化合物会在纯化过程中有损耗。本发明采用高效逆流色谱是萃取得原理，没有 填料，反应产物从进入仪器至产物分离经过数千次萃取过程，并且无化合物残留于仪器内， 属于无损纯化，本发明优化了萃取溶剂和萃取比例，得到了很好的收率。减少了巯基和卤素 反应的副产物，杂质减少，纯化难度降低，收率达65%，纯度99%。
【附图说明】
[0018] 图1本发明工艺流程图。
[0019] 图2为本发明产品色谱图。
[0020] 图3为本发明产品质谱图。
【具体实施方式】
[0021] 下面给出实施例以对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只用 于对本发明作进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根 据本
【发明内容】
对本发明作出的一些分本质的改进和调整，仍属本发明保护范围； 说明书和权利要求书中所使用的缩写含义列于下表中：
保护氨基酸为本公司自产；
实施例1: Fm〇C-Gly-氨基树脂的合成，参照图1， 将氨基树脂142克，替代度为0.4mmol/g，加入到固相反应柱中，加入DCM溶胀树脂30分 钟后，将 34 克 Fmoc-Gly-OH，43 克 HATU， 17克HOAt溶于自己DMF中冷却至5°C，通氮气反应，加入13.7克TMP，室温反应50分钟， DMF洗涤3次，DCM和甲醇轮换洗涤3次。
[0022]固相反应器为砂性漏斗，下部连接三通，三通一端接氮气瓶，三通另一端接抽滤瓶 和真空栗，方便通氮气和抽滤。
[0023]实施例2:Fm〇c-Gly-氨基树脂的合成，参照图1， 将氨基树脂142克，替代度为1.2mmol/g，加入到固相反应柱中，加入DCM溶胀树脂30分 钟后，将 102 克 Fmoc-Gly-OH，129 克 HATU， 51克HOAt溶于自己DMF中冷却至5°C，通氮气反应，加入41.1克TMP，室温反应50分钟， DMF洗涤3次，DCM和甲醇轮换洗涤3次。
[0024]实施例3，参照图1，氨基树脂替代度为0.8mmol/g，偶联剂DIC/HOBt，其余同实施例 1〇
[0025]实施例4,参照图1，偶联剂PyBOP/HOBt，其余同实施例1。
[0026]实施例5，参照图1，偶联剂TBTU/HOBt，其余同实施例1。
[0027] 实施例6，参照图 1，主肽链 Fmoc-Ile-Gln(Trt)