抗菌肽融合蛋白及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术制药工程技术领域，具体涉及一种抗菌肽融合蛋白及其制备 方法，以及该融合蛋白在制备抗菌药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs)是生物体在受到病原微生物侵袭时自身 诱导产生的一类具有抗菌活性的小分子多肽，是天然免疫的主要成分，一般由20-60个氨基 酸残基组成。很多抗菌肽不仅能在较低浓度下有效抑制细菌、病毒、真菌和原虫等多种病原 微生物的生长，甚至还可以杀死肿瘤细胞，而对正常的没有发生病变的真核细胞几乎没有 作用。自从天蚕素被发现以来，人们相继从生物界分离到1700多种抗菌肽，它们的分布极其 广泛，从哺乳动物、甲壳动物、鱼类、昆虫、两栖动物、鸟类到植物、细菌和病毒等均有发现， 其中以昆虫抗菌肽种类最多。
[0003] 死亡素（thanatin)又称死亡肽，是由斑腹刺益條(Podisus maculiveniris)诱导 产生的一种环状昆虫抗菌肽，由21个氨基酸残基组成，其中第8-21位氨基酸残基形成β反向 折叠结构，此结构由11位和18位两个半胱氨酸残基之间形成的二硫键来稳定。死亡素结构 简单，抗菌谱相对广，对G+和0-细菌、某些真菌及原虫都有抑制作用，对哺乳动物细胞不表现 出溶血性，是迄今已知所有昆虫抗菌肽中抗菌谱最广、抗菌活性最强的抗菌蛋白，其最小抑 杀浓度(MIC)约为 0.25-4ug/ml。
[0004] 但目前，抗菌肽大多都是单独存在而发挥其抗菌功能，对不同菌株的杀菌能力还 是存在一定的局限性，且抗菌活性也有待提尚。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是针对以上现有技术，提供一种抗菌肽融合蛋白以及 该融合蛋白的制备方法，该融合蛋白的表达体系蛋白表达量大，利于纯化复性和保持活性， 适用于工业化大生产，且更为重要的是，该融合蛋白抗菌活性高，其本身和编码基因可应用 于抗菌药物制备中，能为抗菌药物制备提供新的良好的材料来源。
[0006] 本发明所采用的技术方案为：
[0007] -种抗菌肽融合蛋白，该蛋白包括抗菌肽thanatin蛋白、orf-91藍肝肽蛋白，所述 抗菌肽thanatin蛋白与orf-91藍肝肽蛋白之间通过3GSA柔性肽片段连接，所述抗菌肽 thanatin蛋白氨基酸序列如SEQ ID N0.8所示，所述orf-91藍肝肽蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述3GSA柔性肽片段如SEQ ID NO. 10所示。即该蛋白从N端-C端依次包含了 抗菌肽thanatin蛋白、3GSA柔性肽、orf-91藍肝肽蛋白，或orf-91藍肝肽蛋白、3GSA柔性肽、 抗菌肽thanatin蛋白。
[0008] 该蛋白是抗菌肽thanatin蛋白编码基因、0rf-91鲨肝肽编码基因、以及位于抗菌 肽thanatin蛋白编码基因与orf-91鲨肝肽编码基因之间的3GSA柔性肽编码基因在基因水 平融合后在原核表达的可溶性重组蛋白。所述抗菌肽融合蛋白的编码基因序列如SEQ ID NO.4所示或如SEQ ID NO.5所示。
[0009]上述抗菌肽融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：
[0010] (1)采用人工合成的方法获得包含抗菌肽thanatin蛋白编码基因序列、3GSA柔性 肽编码基因序列、〇rf-91藍肝肽编码基因的tha-〇rf_91融合基因序列和/或orf_91-tha融 合基因序列，分别如SEQ ID N0.4所示、如SEQ ID N0.5所示；
[0011] (2)以pETDuet质粒为载体，构建重组质粒，并转化至大肠杆菌E.coli TG1中，通过 鉴定、筛选，得到阳性克隆；
[0012] (3)将阳性克隆转化至大肠杆菌宿主菌BL21中，通过氨苄青霉素抗生素的筛选获 得表达菌株；
[0013] (4)挑取阳性单克隆至LB培养基，LB培养基中含50ug/ml氨节青霉素，37°C培养至 OD6Q0为0.5-0.7，加入终浓度0.4mM的IPTG进行蛋白诱导，诱导条件为16 °C培养16-20h，得到 在上清表达的带Sumo标签的融合蛋白；
[0014] (5)对得到的带Sumo标签的融合蛋白进行纯化，然后切除Sumo标签，得到抗菌肽融 合蛋白。
[0015] 本发明进一步提供上述抗菌肽融合蛋白在制备抗菌药物中的应用。
[0016] 本发明还进一步提供上述抗菌肽融合蛋白的编码基因在制备抗菌药物中的应用。
[0017] 与现有技术相比，本发明具有以下显著优点和有益效果：
[0018] (1)通过对抗菌肽基因和orf-91鲨肝肽基因的选择，以及柔性肽和标签蛋白的选 择和合适排布，通过在基因工程上把抗菌肽thanatin和orf-91鲨肝肽基因密码子串联并在 二者间插入3GSA柔性肽的方法，以sumo为融合蛋白，pETDuet为载体，在工程菌E.coli BL21 (DE3)内成功表达在上清的抗菌肽融合蛋白，表达量大，有利于保证后期纯化复性及融合蛋 白活性；
[0019] (2)得到的抗菌肽融合蛋白抗菌活性明显优于thanatin，解决了天然抗菌肽表达 量低，对宿主伤害大，难以通过基因工程手段获得的难题，其本身或编码基因可应用于抗菌 药物制备中，这为研制新一代的抗菌药物打下了基础，具有广泛的应用前景。
【附图说明】
[0020] 图1所示的是本发明实施例1中重组表达载体的双酶切鉴定电泳图，其中M: marker，1: orf_91_tha重组质粒双酶切结果，2 : tha_orf_91重组质粒双酶切结果，3 : pETduet-His-SUMO载体双酶切结果。
[0021] 图2所示的是本发明实施例1中重组表达载体的PCR鉴定电泳图，其中（A)为tha-orf_91重组质粒的菌液PCR鉴定，（B)为orf_91 -tha重组质粒的菌液PCR鉴定。
[0022]图3所示的是本发明实施例2中重组质粒诱导表达的SDS-PAGE鉴定图，其中1-3为 含有tha-〇rf_91基因工程菌，4-6为含有orf_91-tha基因工程菌，1、4:未诱导全菌蛋白，2、 5 :诱导蛋白超声波破碎上清，3、6 :诱导蛋白超声波破碎沉淀，7 :未诱导的pETdue t-Hi s-SUM0空载。
[0023]图4所示的是本发明实施例2中重组融合蛋白表达纯化及SUMO酶切的SDS-PAGE鉴 定图，其中（A)为tha-〇rf_91，（B)为orf_91-tha，l:诱导蛋白超声波破碎后上清，2:诱导蛋 白超声波破碎后沉淀，3:镍柱纯化后蛋白，4:未透析蛋白SUM0酶切，5:透析后蛋白，6:透析 后蛋白SUMO酶切。
[0024] 图5所示的是本发明实施例3中重组蛋白的抑菌活性检测，其中（A)为重组蛋白 tha-〇rf_91对革兰氏阴性菌(大肠杆菌TG1)的抑菌活性检测图，（B)为重组蛋白tha-〇rf_91 对革兰氏阳性菌(枯草芽孢杆菌)抑菌活性检测图，（C)为重组蛋白orf_91-tha对革兰氏阴 性菌(大肠杆菌TG1)抑菌活性检测图，（D)为重组蛋白orf_91-tha对革兰氏阳性菌(枯草芽 孢杆菌)抑菌活性检测图；1: ddH20，2: lmg/mL的Amp 3:纯化、SUM0肽酶切后的重组蛋白4:透 析、SUM0肽酶切后的重组蛋白。
[0025] 图6所示的是本发明实施例3中高浓度组三种不同蛋白的抑菌活性检测，其中（A) 为高浓度组三种不同蛋白Thanatin、orf_91_tha及tha_orf_91对革兰氏阴性菌(大肠杆菌 TG1)抑菌活性检测图，（B)为高浓度组三种不同蛋白Thanatin、orf_91-tha&tha_orf_9Ut 革兰氏阳性菌(枯草芽孢杆菌)抑菌活性检测图;A: Amp，B: Thanatin，C: tha_orf_91，D: orf_ 91_tha，E:ddH2〇。
[0026] 图7所示的是本发明实施例3中低浓度组三种不同蛋白的抑菌活性检测，其中（A) 为低浓度组三种不同蛋白Thanatin、orf_91_tha及tha_orf_91对革兰氏阴性菌(大肠杆菌 TG1)抑菌活性检测图，（B)为低浓度组三种不同蛋白Thanatin、orf_91_tha及tha_orf_91对 革兰氏阳性菌(枯草芽孢杆菌)抑菌活性检测图;A: Amp，B: Thanat in，C: tha_orf_91，D: orf_ 91_tha，E:ddH2〇。
[0027]图8是thanat in氨基酸序列的蛋白结构解析图。
[0028] 图9是tha_orf_91融合蛋白的蛋白结构预测图。
[0029] 图10是orf_91_tha融合蛋白的蛋白结构预测图。
【具体实施方式】
[0030] 以下结合实施例对本发明作进一步具体描述。应该指出，以下具体说明都是例示 性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有说明，本发明使用的所有科学和技术术语 具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。
[0031] 材料和试剂：
[0032] 1.菌种、质粒：
[0033] E.coli TG1菌株、E.coli BL21菌株、枯草芽抱杆菌菌株及质粒pET-duet-His-SUM0由中国科学院上海药物研究所赠予;菌株ρΕΤ-duet-His-SUMO-thanatin由浙江理工大