一种猪睾丸间质祖细胞的长期培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于干细胞技术领域，更具体地，本发明涉及一种猪睾丸间质祖细胞的长 期培养方法，包括体外分离、检测与分化的方法。
【背景技术】
[0002] 在雄性动物睾丸组织中，众所周知在生精小管内侧壁存在着源源不断产生的精子 的一类保持自身数量恒定的精原干细胞;然而在生精小管外侧壁还存在另一类维持增殖与 分化平衡的干细胞，它是睾丸间质干细胞（leydig stem cells，SLCs)，SLCs在经历睾丸间 质祖细胞（progenitor leydig cells，PLCs)、未成熟睾丸间质细胞（immature leydig cells，ILCs )等阶段后，形成具有分泌睾酮功能的成熟睾丸间质细胞（adult leydig cel 1 s，ALCs)，雄性动物体内95%左右的睾酮是由ALCs分泌，对于维持雄性动物体内睾酮水 平的动态平衡具有重要作用。
[0003] 雄激素睾酮是雄性动物体内最为重要的激素之一。幼年时期对于性器官和副性器 官的生长和发育发挥重要作用，而且对肌肉和骨骼的发育也起到重要作用;雄性动物在青 春期出现第二性征，进入成年期后对维持性功能、正常的精子生成起决定性作用。男性睾酮 缺乏综合症是目前影响男性健康与生育能力的主要原因。
[0004] 然而关于SLCs生物学数据并不多，主要是来自啮齿动物的研究，而其他物种的情 况还不清楚。研究发现SLCs特异性高水平表达TOGFRa和白血病抑制因子受体蛋白（LIFR)， 但不表达LHR和类固醇代谢相关的酶(〇￥?11 &1、〇￥?17&1、3七41?和30-批〇)等基因。其中？〇6卩 因子广泛存在生精小管的管周的细胞中，对于促进SLCs的分化有重要的作用。PLCs是由 SLCs分化而来的一类中间阶段的干细胞，具有和SLCs类似形态特征，成纺锤状，但是基因表 达发生了很大的改变，主要表现在出现了类固醇代谢相关酶(CYPllal、CYP17al和StAR)和 少量的的LHR表达，但并没有3f3-HSD的表达，同时它还保留SLCs的标记LIFR和PDGFRa的表 达，表现出分裂能力强的特征。
[0005] 睾酮合成过程相当复杂，胆固醇作为原料，在一系列的酶(〇￥?1141工￥?1741、30-!〇和170-!^〇)及蛋白（31?-81、3七41?、？81〇的作用下转变成为睾酮。而（3?-^1^77、？?41^、 AhR、NFkB、CREB、GATA-4、花生四烯酸、磷酸酯酶、TGF-α、GRTH、SREBP等）等转录因子通过调 控靶基因而影响相应的酶及蛋白的表达水平来调控睾酮合成。下丘脑-垂体-性腺 (hypothalamic-pituitary-testicular ,ΗΡΤ)调节系统所分泌的物质（LH、FSH、PRL、GnRH、 E2、0T、VP、钙离子和碱性成纤维细胞生长因子等)也具有调控间质细胞的睾酮分泌的活动。 胆固醇作为原料在StAR的作用下，从ALCs的线料体外膜转运到膜内；接着，被侧链裂解酶细 胞色素 CYP11A1催化而变成孕烯醇酮;然后，孕烯醇酮在17-羟化酶/17-20裂解酶(CYP17A1) 作用下变成17a-羟孕酮；随后，被17-羟留脱氢酶（17-HSD)催化而变为雄烯二酮;最后，被 存在于ALCs的光面内质网上邪-HSD催化而变成睾酮。
[0006] 猪的器官和人类的器官最为接近，所以猪也是人类医学研究理想的动物模型和异 种器官移植的理想材料，同时猪做为畜牧业最重要的一种饲养动物，关系到国计民生。提高 种公猪的繁育能力，一直是猪育种研究的重点，雄激素睾酮与雄性动物的生育能力息息相 关，所以猪睾丸间质干/祖细胞研究在猪育种研究具有重要的意义，同时也是人类再生医学 良好的模型，意义重大。
【发明内容】
[0007] 基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种猪PLCs的体外分离增 殖培养基、一种猪PLCs的分化培养基和一种猪PLCs的长期培养方法。
[0008] 为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：
[0009] 一种猪PLCs的体外增殖培养基，所述培养基为含10-15%FBS，55yMf3-巯基乙醇， 1%ITS，1%L-谷氨酰胺，1%核苷酸，1000IU/mL LIF，10ng/mL EGF，10ng/mL bFGF，20ng/mL PDGF-BB 和含 l%Penicilin-Stretomycin 的 DMEM 培养基。
[0010] 在其中一些实施例中，所述培养基为含15 %FBS，55μΜβ-疏基乙醇，1 % ITS，1 % L- 谷氨酰胺，1%核苷酸，l〇〇〇IU/mL LIF，10ng/mL EGF，10ng/mL bFGF，20ng/mL PDGF-BB和含 1 %卩6]1；[(3；[1;[11-31^61:01115^;[11的0]\0^[培养基。
[0011] -种猪PLCs的分化培养基，所述培养基为含10-15%FBS，55yMf3-疏基乙醇，1%L- 谷氨酰胺，500 X 胆固醇溶液，Ing/mL LH和含1 %?611；[(3；[1;[11-31^61:01115^;[11的0]\0^[培养基。
[0012] 在其中一些实施例中，所述培养基为含15%FBS，55yMf3-巯基乙醇，1%L-谷氨酰 胺，500 X 胆固醇溶液，Ing/mL LH和含1 %?611；[(3；[1;[11-31^61:01115^;[11的0]\0^[培养基。
[0013] 一种猪PLCs的长期培养方法，包括体外分离、检测和分化方法，包括以下步骤：
[0014] (1)、利用猪PLCs的体外增殖培养基培养仔猪睾丸成纤维细胞，每天半量换液，利 用增殖培养基培养5~8天后，即可得到克隆集落;利用增殖培养基体外持续培养6个月，可 以维持体外自我更新，维持成纤维状的未分化状态，表达PDGFRA1和LIFR干性标记，不表达 分化标记30-HSD;
[0015] (2)、检测步骤(1)获得的克隆集落，证明其为猪PLCs;
[0016] (3)、利用猪PLCs的分化培养基培养间质祖细胞第3天后，猪PLCs开始向成熟睾丸 间质细胞分化;培养15天后，完全分化为成熟睾丸间质细胞。
[0017]在其中一些实施例中，步骤(1)中培养7天。
[0018] 在其中一些实施例中，步骤(3)中培养15天。
[0019] 在其中一些实施例中，步骤(2)中所述检测包括功能蛋白检测、膜表面蛋白分析、 和多潜能性分析(是否具有向脂肪和成骨细胞分化和碱性磷酸酶染色活性）。
[0020] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0021] 1、本发明通过大量实验筛选，首次建立起一套成熟的猪PLCs的分离、培养、检测和 分化的完善方法，最终确立的体外培养体系可以实现控制猪PLCs在体外维持增殖，也可以 在特定的分化系统下向成熟间质细胞、脂肪、成骨细胞分化等。猪PLCs对于可以深入研究期 生物学性质和在动物育种和人类医学模型上应用等具有重要的前景，本发明的方法对于体 外研究PLCs生物学性质，以及药物研发和疫苗生产等方面应用具有潜在应用价值，对于优 选种公猪的猪育种也具有潜在应用前景。
[0022] 2、本发明的方法可以直接应用于猪PLCs生物性质研究，在猪的育种研究中具有潜 在应用价值。
【附图说明】
[0023]图1是本发明的一种猪PLCs的长期培养方法的流程图；
[0024]图2是本发明实施例1的体外分离猪PLCs过程的克隆集落图和RT-PCR检测结果;其 中A:体外高效获得PLCs克隆集落;B: RT-PCR检测结果；
[0025] 图3为本发明实施例2中组织化学染色和免疫荧光检测猪PLCs的功能蛋白的结果；
[0026] 图4为本发明实施例3中流式分析猪PLCs的膜表面蛋白的结果；
[0027] 图5为本发明实施例4中对猪PLCs的多潜能性分析；
[0028]图6为本发明实施例5中猪PLCs向成熟间质细胞诱导分化的检测结果，其中，B、C、 D、E和F:分别为诱导猪PLCs向间质分化过程中的第1、3、6、9、12和15天观察结果;G:睾酮检 测结果;H:RT-PCR检测结果；I、J、K、L、M和N:分别为PDGFRAl、LIFR、CYPllAl、CYP17Al、StAR 和3i3-HSD免疫荧光染色结果。
【具体实施方式】
[0029]下面结合附图和具体实施例来对本发明作进一步说明。
[0030] 以下实施例中，roGFRal (兔源）、3f3-HSD(兔源）、CD73(兔源）和CD44(大鼠源）单抗 购于Abea