一种针对人EDIL3基因的siRNA及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，具体地说，是一种特异性抑制EDIL3的小核酸干扰 分子，以及在制备治疗新生血管性疾病药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 新生血管是一种在原有血管的基础上生长出新血管的过程，其具有重要的生理及 病理意义。新生儿的新生血管生成利于组织器官的生长，然而在成年后，大部分血管维持在 静止状态;在病理性刺激下，血管内皮内皮细胞可以恢复增殖能力，进而促进新生血管形 成。病理性新生血管的生成涉及到多种细胞因子的分泌及调节紊乱，并参与了多种疾病的 发生发展，如肿瘤、糖尿病视网膜病变、类风湿性关节炎及肺动脉高压等。在过去的十数年 间，研究人员进行了大量研究探询抑制新生血管的治疗策略，以期预防和治疗肿瘤、眼底和 皮肤病变等。目前抗新生血管药物，血管内皮生长因子单抗，已经应用于临床治疗新生血管 性疾病。然而，由于血管内皮生长因子单抗发挥作用时效较短，需要多次治疗，并且对增殖 期糖尿病视网膜病变效果不佳。因此，寻求其它安全有效的治疗手段，对治疗新生血管性疾 病具有重要的意义。
[0003] RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术是近来发展日趋成熟的一门基因沉默技 术，是内源性或外源性的双链RNA在基因转录后水平上，介导细胞内信使RNA(mRNA)发生特 异性降解，导致靶基因表达沉默，从而产生相应功能表型的缺失，是特异性抑制靶基因表达 的过程，具有高效性、特异性的特点。在不影响正常基因功能的前提下，RNA干扰可以抑制重 要基因的表达，从而达到基因治疗的目的，其对靶基因具有很好特异性及对目的基因抑制 作用是其它药物难以匹敌的。随着RNA干扰技术的不断完善，针对病理性新生血管的RNAi具 有广阔的应用前景。
[0004] 表皮生长因子样重复折叠1结构域蛋白3(EGF_like repeat and discoidin I-like domain-containing protein 3，EDIL3，also known as Del-1 and integrin- binding DELI)是内皮细胞分泌分子量大小为52kDa的胞外基质相关糖蛋白。早期研究发现 EDIL3在胚胎内皮细胞中短暂表达，并可以促进血管内皮细胞的粘附和迀移（Aoka Y， Johnson FL，Penta K，Hirata Ki K，Hidai C,Schatzman R,Varner JA，Quertermous T.The embryonic angiogenic factor Dell accelerates tumor growth by enhancing vascular formation.Microvasc Res.2002 <]\11;64(1):148-61)。近来研究发现，EDIL3在 许多肿瘤中高表达，且与肿瘤预后密切相关(Sun JC,Liang XT,Pan K,Wang H,Zhao JJ,Li JJ，Ma HQ,Chen YB,Xia JC.High expression level of EDIL3 in HCC predicts poor prognosis of HCC patients.World J Gastroenterol.2010 Sep 28 ； 16(36):4611-5.ffatanabe T1 , Kobunai T , Yamamoto Y,Ikeuchi H, Mat suda K , Ishihara S.et.al.Predicting ulcerative colitis-associated colorectal cancer using reverse-transcription polymerase chain reaction analysis. Clin Colorectal Cancer. 2011 Jun; 10(2): 134-41)。这些研究表明EDIL3在血管形成及肿瘤发生发展过程中 起着重要作用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种特异性抑制EDIL3的siRNA，本发明另一目的在于提供 该siRNA在制备治疗新生血管性疾病药物中的应用。
[0006] 本发明以RNA干扰技术为基础，从NCBI基因数据库中获得EDIL3的CDNA序列(Gene ID: 10085)，根据siRNA靶序列的基本原则，针对EWL3设计了三条21个核苷酸的siRNA，其序 列如下，
[0008] 以上所述的SiRNA还可以在正义链和反义链的3'端再加上TT以增加 SiRNA的稳定 性。
[0009] 将上述干扰RNA转染进脐静脉血管内皮细胞后发现，siRNAl抑制EDIL3基因表达的 干扰效果最明显。
[0010] 本发明的第一方面，提供一种抑制人表皮生长因子样重复折叠1结构域蛋白3 (EDIL3)的干扰序列（siRNAl)，其序列如下：
[0011] 正义链5'-GGUGAUAUUUGUGAUCCCA-3'（SEQ ID N0:1)
[0012] 反义链5'-UGGGAUCACAAAUAUCACC-3'（SEQ ID N0:2)
[0013] 所述的正义链和反义链还可以在3'端再加上TT以增加 siRNA的稳定性。
[0014]本发明的第二方面，提供上述抑制人EDIL3的干扰序列（siRNAl)在制备人EDIL3抑 制剂中的应用。
[0015] 本发明的第三方面，提供上述抑制人EDIL3的干扰序列（SiRNAl)在制备治疗新生 血管性疾病药物中的应用。
[0016] 所述的抑制人EDIL3的干扰序列（SiRNAl)通过抑制EDIL3基因表达抑制血管内皮 细胞的增殖、迀移、管样形成。
[0017] 所述的新生血管性疾病，具体是指一种病理性新生血管的生成症状，即在病理性 刺激下，血管内皮内皮细胞恢复增殖能力，在原有血管基础上生长出新血管，例如炎症性疾 病、肿瘤、糖尿病视网膜病变、类风湿性关节炎及肺动脉高压等等。
[0018] 本发明的第四方面，提供一种重组载体，所述的重组载体中包含上述的抑制人 EDIL3的干扰序列（siRNAl)。
[0019] 所述的重组载体在制备人ED IL3抑制剂中的应用。
[0020] 所述的重组载体在制备治疗新生血管性疾病药物中的应用。
[0021]本发明的第五方面，提供一种药物组合物，所述的药物组合物中包含上述的抑制 人EDIL3的干扰序列（siRNAl)，以及药学上可接受的载体。
[0022]所述的药物组合物在制备人ED IL3抑制剂中的应用。
[0023]所述的药物组合物在制备治疗新生血管性疾病药物中的应用。
[0024]本发明优点在于：
[0025] 1、本发明针对ED IL3基因表达的s iRNA，可以抑制脐静脉血管内皮细胞的增殖、迀 移、管样形成，可以诱导细胞周期的阻滞；
[0026] 2、本发明siRNA可以用于制备成稳定、有效、低毒的抑制EDIL3表达的、治疗新生血 管性疾病的生物靶向制剂或药物。
【附图说明】
[0027]图1为EDIL3基因干扰后脐静脉血管内皮细胞EDIL3的mRNA表达及蛋白表达水平效 果图；其中A为蛋白凝胶电泳图，B为mRNA表达量统计图。
[0028]图2为EDIL3基因干扰后对脐静脉血管内皮细胞增殖能力的统计图。
[0029] 图3为EDIL3基因干扰后对脐静脉血管内皮细胞迀移能力的影响图及统计图，其中 A为空白对照组光镜图，B为阴性对照组光镜图，C为干扰组光镜图，D为统计图。
[0030] 图4为EDIL3基因干扰后对脐静脉血管内皮细胞管样形成能力的影响图及统计图， 其中A为空白对照组光镜图，B为阴性对照组光镜图，C为干扰组光镜图，D为统计图。
[0031] 图5为EDIL3基因干扰效率及干扰后对晶状体上皮细胞增殖能力的统计图，其中 AEDIL3基因干扰后晶状体上皮细胞EDIL3蛋白表达水平效果图；B为晶状体上皮细胞增殖能 力的统计图。
【具体实施方式】
[0032]下面结合实施例对本发明提供的【具体实施方式】作详细说明。
[0033] 和附图，对本发明作进一步描述，但本发明的实施并不仅限于此。
[0034] 以下实施例中所使用的技术，包括PCR扩增与检测、细胞转染、RNA提取及反转录等 分子生物学技术，以及细胞培养、检测技术等，除非特别说明均为本领域内的技术人员已知 的常规技术;所使用的仪器设备、试剂和细胞系等，除非是本说明特别注明，均为一般本领 域的研究和技术人员可以通过公共途径获得的。
[0035] 实施例l:siRNA的合成
[0036] 检索NCBI GeneBank得到EDIL3全序列和mRNA序列，利用现有的网络资源及常用软 件对EDIL3进行生物学分析，选择编码区作为siRNA设计的靶序列。参照siRNA设计原则，并 通过GeneBank数据库的blast功能与人类基因组序列进行对比，确保无同源性；排除 aiti sense链的5'端连续8个碱基与其它基因配对的潜在siRNA;排除任何一段连续14个碱 基与其它基因配对的潜在siRNA。
[0037]本实施例设计并合成的siRNA序列如下所示，正义链和反义链都在3'端再加上TT 以增加 siRNA的稳定性。
[00381
[0
[0040] 从图1