布鲁氏菌的非编码小RNA分子ncRNA1351及其应用
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及细菌非编码小RNA(small non-coding RNA，sRNA)，特别是涉及一个来 源于布鲁氏菌的非编码小RNA分子ncRNA1351及其功能与应用。
【背景技术】
[0002] 细菌非编码小RNA(small non-coding RNA，sRNA)是近年来在细菌等原核生物中 发现的一类RNA调控子，它们不编码蛋白质，通常位于基因间区，长度在50-400个核苷酸之 间，广泛参与体内多种生命活动的调控。目前，非编码小RNA已成为生命科学研究的前沿和 热点。细菌sRNA是细菌代谢、毒力和适应环境压力的重要调节因子，在应对环境变化的基因 表达调控中发挥重要作用。sRNA主要通过碱基配对与靶标mRNA结合来发挥生物调控作用。 迄今为止，大部分细菌sRNA的研究集中在大肠杆菌等模式生物，但随着研究的深入，已有越 来越多的研究转向致病菌，如:霍乱弧菌、产单核细胞李斯特菌、铜绿假单胞菌、结核杆菌、 沙门氏菌、肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌等。在这些病原菌中，已经证实sRNA在转录后水平 调控基因的表达，并在压力应答和毒力调控中发挥重要作用。
[0003] 布鲁氏菌病是由布鲁氏菌入侵机体引起的人畜共患传染病，在我国广泛流行，不 仅给我国畜牧业生产造成巨大的经济损失，也严重威胁人民的健康生活，是一个重要的公 共卫生问题。布鲁氏菌是胞内寄生菌，主要寄生于机体的单核细胞(主要是巨噬细胞）内，胞 内存活和复制是布鲁氏菌致病的关键，而适应胞内的环境又是布鲁氏菌实现胞内生存的关 键。因此，了解布鲁氏菌如何适应胞内的恶劣环境并在其中生存对于理解布鲁氏菌的致病 机理至关重要。由于sRNA是细菌适应环境压力的重要调节因子，发明人推测出sRNA在布鲁 氏菌的胞内生存和毒力调控中发挥一定的作用。因此，识别布鲁氏菌的sRNA并对其功能进 行研究将有助于理解布鲁氏菌的致病机理。已有研究人员对布鲁氏菌非编码小RNA进行了 预测，包括BSR-2，BSR-16等，专利文献CN103710345A也公开了一个与布鲁氏菌的胞内生存 和毒力相关的布鲁氏菌非编码小RNA。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是寻找并提供一个更具利用价值的来源于布鲁氏菌的非编码小RNA 分子。
[0005] 本发明所提供的来源于布鲁氏菌的非编码小RNA分子（small non-coding RNA， sRNA)，命名为ncRNA1351，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:1所示，或与序列表中SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列具有90%以上同源性并与布鲁氏菌毒力和胞内生存能力相关的 核苷酸序列，或为序列表中SEQ IDN0:1所示核苷酸序列经硫代修饰或/和甲氧基修饰得到 的核苷酸序列。
[0006] ncRNA1351缺失突变载体和ncRNA1351回复载体也属于本发明。
[0007] 所述ncRNA1351缺失突变载体具体可命名为ncRNA1351-NC-T，其核苷酸序列如序 列表中SEQ ID N0:2所示。
[0008] 所述ncRNA1351回复载体具体可命名为ncRNA1351-MCS，其核苷酸序列如序列表中 SEQIDN0:3**。
[0009] 转化有ncRNA1351缺失突变载体的布鲁氏菌ncRNA1351缺失突变株和转化有 ncRNA1351回复载体的布鲁氏菌ncRNA1351回复株也属于本发明。
[0010] 以布鲁氏菌(Brucella melitensis)16M为出发菌株，构建的ncRNA1351缺失突变 株命名为16M Δ ncRNA1351，也属于本发明。
[0011] 以布鲁氏菌(Brucella melitensis)16M为出发菌株，构建的ncRNA1351回复株命 名为16M-ncRNA1351，也属于本发明。
[0012] 本发明用生物信息学的方法预测和分析出一个新的布鲁氏菌非编码小 RNAncRNA1351 aNorthern blot实验证实了ncRNA1351在布鲁氏菌中的存在。通过构建 ncRNA1351的布鲁氏菌缺失突变株和回复株对ncRNA1351的功能进行了分析，实验结果表 明:ncRNA1351缺失以后，布鲁氏菌在模拟巨噬细胞内环境的压力条件下的生存能力明显减 弱，而且在小鼠体内的生存能力也下降，说明ncRNAl 351与布鲁氏菌的毒力相关。因此，可以 ncRNA1351为靶点制备抗布鲁氏菌药物，其长105nt，相较于已有研究的RNA BSR0601的长度 更短，更具有应用价值。本发明将在布鲁氏菌病的预防和治疗中发挥重要作用。
[0013] 下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
【附图说明】
[0014] 图1为ncRNA1351在布鲁氏菌(Brucella melitensis)16M不同生长时期表达情况 的Northern blot检测结果；
[0015] 图2为ncRNAl 351在酸、热、营养缺乏、氧化应激等模拟巨噬细胞内环境的不同应激 条件下的转录情况；
[0016] 图3A为ncRNA1351缺失突变载体ncRNA1351-NC-T的物理图谱；
[0017] 图3B为ncRNAl 351回复载体ncRNAl 351-MCS的物理图谱；
[0018] 图 4 为ncRNA1351 缺失突变株 16MAncRNA1351 和ncRNA1351 回复株 16M-ncRNA1351 的RT-PCR鉴定结果；
[0019] 图 5 为ncRNA1351 缺失突变株 16MAncRNA1351 和ncRNA1351 回复株 16M-ncRNA1351 在模拟巨噬细胞内环境的压力条件下的生存能力分析结果；
[0020] 图 6 为ncRNA1351 缺失突变株 16MAncRNA1351 和ncRNA1351 回复株 16M-ncRNA1351 的小鼠毒力实验结果。
【具体实施方式】
[0021] 下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见： 《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》（Sambrook，J·，Russel1，David ff., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 3rd edit ion，2001，NY，Cold Spring Harbor)〇
[0022] 所述百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/lOOmL)百分比浓度、质 量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/100mL)百分比浓度。
[0023] 实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达 到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的 来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提 示替换使用。
[0024]羊布鲁氏菌（Brucella melitensis或B.melitensis) 16M(野生株）由国家CDC提 供。
[0025] 所用引物和探针由大连宝生物公司合成，质粒由上海生工生物工程有限公司合 成。
[0026] 实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的 操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[0027] 实施例1、获得布鲁氏菌的非编码小RNA分子ncRNA1351的序列
[0028] 从NCBI(ftp://ftp.ncbi ·nih.gov/genomes/Bacteria/)下载布鲁氏菌（Brucella melitensis 或 B.melitensis)16M(野生株）的染色体序列（NC_003317.1 和NC_003318.1 两条 染色体，命名为I和II)，从下载的序列中提取基因间区（指的是两个开放阅读框之间的序 列）片段。在基因间区用 pftools 2.3(http://www .isrec.isb-sib.ch/ftp-server/ pftools/)寻找启动子（cut-off (阈值）值取255)，用RNAMotif寻找终止子，其中的motif descriptor(主题描述符）来自（http://www .tufts.edu/sackler/waldorlab/ sRNAPredict/)，然后再在去冗余(指的是重复的序列）基础上预测出具有完整转录单元的 基因间区，去除含有tRNA和rRNA的序列，最后，通过BLAST比对，找出保守的基因间区作为候 选的（small non-coding RNA，sRNA)序列。
[0029] 在候选的sRNA序列中，ncRNA1351 是在布鲁氏菌(Brucella melitensis) 16M I号 染色体的反义链上预测的非编码小RNA，其核苷酸序列如序列表中SEQ IDN0:1所示，其5'端 为1405195(指的是Genbank里面的序列号），3'端为1405091(指的是Genbank里面的序列 号），长105nt，其编码基因位于（Brucella melitensis) 16M的BMEI1351 (指的是Genbank里 面的位点号码)和BME11350 (指的是Genbank里面的位点号码)之间的基因间区。BLAST比对 结果表明，ncRNA1351在布鲁氏菌菌种间的同源性达到100%，说明ncRNA1351具有高度的保 守性，这一点也符合sRNA的特征。
[0030] 实施例2、ncRNA1351在布鲁氏菌16M不同生长时期表达情况的Northern blot验证 [0031 ] Northern blot是鉴定非编码小RNA的金标准。由于非编码小RNA的表达通常具有 生长时期依赖性，因此，可用Northern blot检测ncRNA1351在布鲁氏菌16M不同生长时期的 表达情况。具体方法包括以下步骤：
[0032] 1)根据ncRNA1351的编码序列设计引物，并在反向引物外侧添加 T7启动子序列，弓丨 物序列为ncRNA1351-p-F:ACGGTCGAGAAATTGCGA 和ncRNA1351-p-R: TAATACGACTCACTATAGGGAACCGATGGCTTTCCGGG(带下划线序列为T7启动子序列）。
[0033] 2)首先以羊布鲁氏菌(Brucella melitensis)16M(野生株）的基因组DNA为模版， 用引物ncRNA1351-p-F和ncRNA1351-p-R PCR扩增制备探针的DNA模板，25μ1 PCR反应体系 为：10Xbuffer 2.5yl，dNTPs(2.5mmol/L)2yU|*ncRNA1351-p-F(10ymol/L)0.5yU|* ncRNA135卜p-R(10