一种采用酵母菌评价油田钻井液生物毒性的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及钻井液生物毒性的评价方法，具体涉及一种采用酵母菌评价油田钻井 液生物毒性的方法。
【背景技术】
[0002] 油田钻井液是油井钻探过程中在钻孔内使用的循环冲洗介质，主要由液相、固相 和化学处理剂组成。液相可以是水(淡水、盐水)、油（原油、柴油）或乳状液(混油乳化液、反 相乳化液）等；固相包括有用固相(膨润土、加重材料）和无用固相(岩石）等；化学处理剂包 括无机、有机及高分子化合物等。
[0003] 随着石油工业的持续发展，油田钻井液的成分越来越复杂，其生物毒性对环境的 影响亦越来越明显。因此，以生物毒性为评价指标，强化油田钻井液源头控制措施，避免后 续环境污染，已成为当前迫切需要解决的问题。
[0004] 目前，国内外尚无统一的油田钻井液生物毒性检测方法及分级标准。美国石油学 会推荐执行的《钻井液生物毒性测定标准》采用巴西拟糠虾作为实验生物，由于该实验生物 物种在我国无分布且脆弱易死亡，我国学者致力于寻找新的实验生物。
[0005] 中国国家标准《海洋石油勘探开发污染物生物毒性检验方法》（GB/ T18420. 2-2001)提到以虾龄小于10d的小仔虾或刚孵化的卤虫幼体作为实验生物，但该方 法应用于油田钻井液生物毒性评价存在以下问题：（1)实验物种来源不便，挑选条件不易 掌握，虾龄要求苛刻，要求技术人员在专业实验室进行操作实验，不便推广应用；（2)耗时， 每次实验需96h以上且成本高；（3)操作过程复杂，实验技术不易掌握，不能现场应用。
[0006] 中国石油天然气集团公司企业标准《油田化学剂、钻井液生物毒性分级及检测方 法-发光细菌法》（Q/SY111-2007)是根据发光细菌发光度与存活菌体数量成线性正相关的 特性，通过计算油田钻井液对发光细菌的致死率来得出油田钻井液的生物毒性水平，但多 数油田钻井液所呈现的黑褐色在发光细菌的发光波段有干扰，需要对各个样品逐一进行校 正后才能使用。
[0007] CN102031280A公开了一种利用海洋微藻评价油田钻井液生物毒性的方法，该方法 要求使用天然海水对钻井液样品进行处理，在测试过程中要求将油田钻井液与海洋微藻混 合7~8h后才能得到生物毒性级别。该法由于测试材料受限、评价周期较长等特点，不适 用于快速评价油田钻井液的生物毒性。
[0008] 综上，在油田钻探开发和生产过程中，亟需寻找一种能够作为生物毒性评价的实 验生物，使其能在油田钻井液作用下，快速、有效及准确的测得油田钻井液的生物毒性，从 而建立起油田钻井液生物毒性快速评价方法。
【发明内容】
[0009] 针对现有技术的不足，本发明提供一种采用酵母菌评价油田钻井液生物毒性的方 法。本发明采用同步培养得到的形态均一的酵母菌作为实验生物，可以在较短的反应时间 内灵敏高效、稳定准确的评价油田钻井液的生物毒性，能够满足油田开发及生产中对快速 评价油田钻井液生物毒性的需求。
[0010] 本发明采用酵母菌评价油田钻井液生物毒性的方法，包括如下内容： (1) 将酵母菌进行活化并培养至稳定期，得到的酵母菌培养液进行离心； (2) 将上述离心后酵母菌体重悬后进行不连续密度梯度离心，收集最上层包含幼龄酵 母菌或孢子的不连续密度梯度溶液，进行同步培养； (3) 直接采用上述同步培养后得到的酵母菌作为评价菌种，或将酵母菌制成冻干粉剂 使用； (4) 使用标准毒性物质对酵母菌的生物毒性敏感性进行校正，同时确定油田钻井液对 酵母菌的生物毒性分级指标； (5) 将酵母菌稀释成一定菌体浓度的酵母菌悬液，并按浓度梯度制备油田钻井液测试 样品； (6) 将酵母菌悬液与油田钻井液测试样品接触一定时间，通过染色法检测各浓度油田 钻井液测试样品对酵母菌的致死率； (7) 计算油田钻井液测试样品对酵母菌的半数有效浓度（EC5。)，根据生物毒性分级指标 确定油田钻井液生物毒性等级。
[0011] 本发明方法中，所述的酵母菌选自酿酒酵母ce/wisiae)、葡萄 汁酵母i/Kari/a?)、汉逊酵母（/fease/wia)、球拟酵母（Tbri/io/wis)、假丝酵 母)、毕赤氏酵母（/VcAia)、红酵母)、棉病针抱酵母(Afevas tejOara 或白地霉（feoiricA· cawi/ii/·)等，优选酿酒酵母 cerevisiae)。
[0012] 本发明方法中，酵母菌的活化和培养采用本领技术人员熟知的方式。具体可以采 用以下方式：首先制备酵母菌种子液，然后按照10%接种量（v/V)将酵母菌种子液接种于新 鲜培养基进行扩大培养，培养温度25~35°C，摇床转速100~150rpm，培养至稳定期结束。 将上述酵母菌培养液在500~1000g离心力下离心并收集菌体。
[0013] 本发明方法中，制备不连续密度梯度离心的介质可以为甘油、1，3_丙二醇、蔗糖、 乳糖、海藻糖、脱脂乳中的一种或几种，优选为海藻糖。选择海藻糖作为离心介质时，不连续 密度梯度溶液的制备方法为：在离心瓶中自下而上逐层铺加浓度递减的海藻糖水溶液，海 藻糖水溶液的质量浓度为5%~70%，每层浓度逐级减少5%~30%。本发明可以铺加3-5层， 优选3层海藻糖水溶液，每层体积相同或不同，优选最上层的海藻糖水溶液体积是其他层 的1. 5~3倍，以此制成海藻糖不连续密度梯度溶液。待离心酵母菌液的制备：取步骤（1) 收集的酵母菌体，然后用少量去离子水重新悬浮，将重悬后的酵母菌液铺在制备好的海藻 糖不连续密度梯度溶液顶层，在50~100g离心力下离心5~10min，收集最上层不连续密 度梯度溶液，将其中包含的幼龄酵母菌或孢子进行同步培养。同步培养温度为25~35°C， 摇床转速为100~150rpm。在同步培养时，可以加入5~30g/L的糖蜜，有助于酵母菌的活 性稳定并提高其耐受能力。
[0014] 本发明方法中，进行生物毒性评价用的酵母菌悬液可以采用同步培养酵母菌液直 接稀释得到，也可以由酵母菌冻干粉剂复溶得到。由于油田钻井液经常需要在现场评价，因 此最好制备成酵母菌冻干粉剂。将同步培养酵母菌液制成冻干粉剂，具体过程为：将酵母 菌同步培养液在500~lOOOg离心力下离心并收集菌体，用20 wt%~50 wt%的冷冻干燥 保护剂水溶液将收集到的菌体重新混悬，再分装于安剖管中进行冷冻干燥，先在4°C下维持 6~8h、再在-20°C冰箱中维持6~8h、最后在-80°C维持24~48h ;冷冻干燥时控制冻干 机温度-50~_80°C、真空度1~10pa、冷冻干燥时间24~48h，直至样品表面出现裂痕，与 冻干管内壁有脱落现象。本发明中，冷冻干燥保护剂为甘油、乳糖、海藻糖、脱脂乳中的一种 或几种，优选海藻糖。经过冷冻干燥后，最终制备的冻干粉剂中酵母菌的存活率(存活率是 酵母菌中活细胞数占总细胞数的百分比）不低于70%。
[0015] 本发明方法中，酵母菌冻干粉剂复溶或酵母菌同步培养液稀释后的酵母菌悬液中 菌体浓度范围为1〇 4~10s个/mL。酵母菌复溶或稀释采用去离子水、生理盐水或磷酸盐缓 冲液，优选去离子水。
[0016] 本发明方法中，酵母菌悬液与油田钻井液测试样品接触时间为1~lOmin。
[0017] 本发明方法中，使用吕氏碱性美蓝染液进行染色处理；使用血球计数板和光学显 微镜对酵母菌活细胞和死细胞进行镜检计数并计算致死率。
[0018] 本发明方法中，以标准毒性物质氯化汞确定生物毒性分级指标。
[0019] 本发明方法中，若需测定包括pH影响在内的油田钻井液生物毒性，不应调节测试 样品pH值；若需测定排除pH影响在内的油田钻井液生物毒性，应调节测试样品pH值至 7. 0。本发明方法中，制备油田钻井液测试样品的浓度梯度为lOVg/UlOkg/LUO^ig/L、 103mg/L、10 4mg/L、105mg/L及106mg/L ;油田钻井液样品的稀释液为去离子水。
[0020] 与现有技术相比，本发明的有益效果在于： 1、通过不连续密度梯度离心和同步培养获得了活性稳定、形态均一的酵母菌，将该酵 母菌或者其冻干粉剂用于油田钻井液生物毒性评价，实验结果表明其对油田钻井液生物毒 性评价结果与发光细菌法一致，可用于钻井液生物毒性的快速评价。
[0021] 2、冻干粉剂便于酵母菌长期储藏，保证了酵母菌的存活率不低于70%，也使本发明 方法实现了一次制备、多次使用，节省了后期油田钻井液生物毒性评价实验的准备时间。
[0022] 3、本发明方法具有反应灵敏高效、测试结果稳定准确、步骤易流程化、适用性强等 优点，可以满足油田开发及生产中对快速评价油田钻井液生物毒性的需求。与现有评价方 法相比，时间缩短至lh以内；并且可以直接使用酵母菌冻干粉剂，所使用的评价设备成本 低、方便携带，能够在油田钻井现场进行油田钻井液生物毒性评价实验，具有流程化应用前 旦
【具体实施方式】
[0023] 本发明中，采