与烟草株高发育性状紧密连锁分子标记的获得方法
【技术领域】
[0001] 本发明公开了一种与烟草株高发育性状紧密连锁分子标记的获得方法，属于烟草 育种和分子遗传学领域，适用于烟草重要数量性状主效基因定位、克隆及烟草新品种辅助 选择育种。
【背景技术】
[0002] 烟草株高是烟草形态建成的最重要性状，同时烟草的株高也和产量、品质以及非 生物胁迫有密切关系，所以一直是烟草育种改良的重要目标性状之一。但是烟草株高的遗 传呈现数量性状遗传特征，容易受环境、不同遗传背景等因素的影响，利用传统的常规育种 手段来改良烟草株高耗时、费工且选择不准确，具有一定的局限性。而与传统方法相比，利 用分子标记可以从DNA水平直接筛选目标材料，弥补传统育种的局限性，大大缩短育种过 程，因此，通过定位数量性状位点，发掘与之紧密连锁的分子标记，进而利用分子标记辅助 选择来进行烟草形态建成目标性状改良是一种行之有效的手段。
[0003] 随着分子标记技术的不断发展，各种不同的分子标记已经在数量性状基因座 (QTL)定位和遗传图谱构建中被广泛利用。简单重复序列（SSR)标记与随机扩增多态性 (RAPD)、限制性长度差异多态性（RFLP)等分子标记相比具备几个优势，它们具有更高的多 态性、更高的密度，而且特别适合烟草这样的多倍体植物，因此，近几年，SSR标记已经逐渐 被应用于烟草遗传图谱构建和QTL定位研究。
[0004] 基于连锁分析的QTL定位是研究数量性状的重要方法之一，其基本原理是利用分 子标记位点与引起表型差异的位点（QTL)之间的重组进行定位。该方法已经在很多重要作 物如水稻、小麦和玉米上广泛利用，其中，基于连锁分析理论的极端池分离分析方法（BSA) 是一种快速、高效的方法。其基本原理是根据目标性状的表型对分离群体进行分组混合DNA 构建极端池，然后在极端池和亲本间筛选与目标性状连锁的分子标记。
[0005] 关联分析作图是另一种研究数量性状的重要方法，其基本原理是利用引起表型差 异的位点与分子标记间的连锁不平衡来定位QTL。与连锁分析相比，在定位QTL方面关联分 析作图具有以下优势：首先，因为关联分析使用的是自然群体，所以不需要花费时间来构建 人工群体；其次，可以一次检测多个等位基因变异；最后，精度大，可以达到单基因水平。但 是，关联分析作图也存在假阳性较高等缺点。
[0006] 因此，将连锁分析和关联分析两种方法联合起来进行QTL定位是最理想的研究数 量性状遗传的策略，但是，到目前为止，在烟草上利用连锁分析和关联分析联合发掘株高性 状QTL的方法还未见报道。本发明联合基于连锁分析的BSA分析法和关联分析方法定位与 烟草株高性状相关的QTL，发掘与主效QTL紧密连锁的分子标记，为烟草株高发育性状相关 基因克隆、分子标记开发和新品种培育奠定理论基础。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于克服现有技术存在的以上问题，提供一种与烟草株高发育性状 紧密连锁分子标记的获得方法，针对烟草株高发育性状相关基因精细定位、克隆及分子辅 助育种研究在国内外几乎空白的现状，利用基于BSA连锁分析和关联分析的方法筛选出烟 草株高性状相关的主效QTL -个或多个，获得与之紧密关联的分子标记，为烟草形态发育 相关基因精细定位、克隆及新品种选育奠定基础，同时也为烟草株高性状分子辅助选择提 供可用标记。。
[0008] 为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：
[0009] -种与烟草株高发育性状紧密连锁分子标记的获得方法，建立一种获得烟草株高 发育性状紧密连锁分子标记的新方法，包括以下步骤：
[0010] A)烟草株高性状的表型获得，供试材料为保存于中国农业科学院烟草研究所"国 家烟草种质库"中的种质，其中NC82和抗88用作连锁分析的亲本材料，96份烟草种质资 源，包括86份烤烟类型种质、2份白肋烟类型种质、1份雪茄烟类型种质和7份晒晾烟类型 种质作为关联分析的自然群体，在不同年份和不同地点在始花期调查株高性状；
[0011] B)基于连锁分析的烟草主效QTL定位，其中包括：
[0012] 1)采用CTAB方法提取亲本和群体基因组DNA，
[0013] 2)根据表型鉴定结果，从F2群体中各选取极端高和极端低的10个单株个体，等量 混合DNA，构建两个极端池，进而在双亲及两个极端池间筛选与目标性状连锁的SSR分子标 记，鉴定出的标记进一步在整个匕群体（193个单株）中分析基因型，
[0014] 3)主效QTL定位分析，利用F2群体SSR基因型，结合FJPF2 : 3两年表型数据，进 行QTL定位，利用的分析软件为Icimapping3. 2，L0D阈值设为2. 5,当某一位点的L0D值大 于2. 5时即认为该处存在一个显著QTL位点，采用的统计学方法为完备区间作图法，并估算 相关遗传参数，相关遗传参数包括QTL位置、加性效应、对表型变异的加性贡献率和显性贡 献率；
[0015] C)基于关联分析的烟草株高QTL定位，根据连锁分析定位结果，在所在区间加密 SSR标记，利用加密的SSR标记分析自然群体，结合连续两年不同地点的表型数据，进行关 联分析作图，首先利用structure. 2对自然群体进行群体结构分析，估算最佳群体组群数 K值，取值范围2-10 ;将MCMC开始时的不作数迭代设为100000,迭代次数设为100000,采用 定位软件Tassel4.0-般线性模型（GLM)开展标记与性状的关联分析。GLM分析中以Q矩 阵作为协变量进行回归分析。利用上述方法，首先对相关QTL位点进行关联分析验证，同时 进一步缩小QTL所在标记区间位置，发掘影响烟草株高性状的主效QTL紧密连锁的分子标 记。
[0016] 进一步的，还包括发掘一个影响烟草株高发育性状的主效QTL，命名为qPH-12,与 SSR标记PT55174紧密连锁，位于烟草12号连锁群区间PT53703-PT60823之间，在F2群体 中可以解释12. 9 %的表型遗传变异，在F2 : 3群体中可以解释13. 8 %的表型遗传变异，在自 然群体中两年分别解释的表型遗传变异为13. 9%和14. 4%。
[0017] 进一步的，所述与烟草株高发育性状QTL紧密连锁的分子标记PT55174,该 标记的上游序列为SEQ ID NO. 1 (TGCTTCCTGCTTCATACGTG)，下游引物序列为SEQ ID NO. 2 (GGCTTGACTTCCATTTAATTTCC)。
[0018] 本发明的有益效果是：
[0019] 本发明建立了一种烟草株高形态发育紧密连锁分子标记发掘的方法，同时在国际 上首次在烟草12号连锁群上定位到一个新的影响株高发育的主效QTL，发现一个与之紧密 连锁的分子标记PT55174。建立的数量性状主效QTL发掘方法和鉴定的分子标记对烟草株 商主效基因的克隆和新品种选育具有重要意义。
[0020] 1、建立了一种联合连锁分析和关联分析发掘烟草株高发育性状紧密连锁分子标 记的方法。
[0021] 2、首次定位到一个和烟草株高性状相关的主效QTL，为进一步精细定位和克隆相 关基因奠定了很好的基础。
[0022] 3、获得一个与烟草株高发育性状紧密连锁的分子标记PT55174。在不同群体和不 同环境条件下，该标记与烟草株高发育性状都存在显著性关联，在育种实践中有很好的应 用前景。
[0023] 上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段， 并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。 本发明的【具体实施方式】由以下实施例及其附图详细给出。
【附图说明】
[0024] 此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发 明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
[0025] 图1为联合连锁分析和关联分析方法确定的烟草株高发育主效QTL位置及与之紧 密连锁的分子标记。
[0026] 图中，A表示连锁分析方法QTL定位结果；B表示关联分析对主效QTL位点进一步 验证及与之紧密连锁的分子标记；"* "表示与烟草株高发育性状主效QTL紧密连锁的分 子标记。
【具体实施方式】
[0027] 下面将参考附图并结合实施例，来详细说明本发明。
[0028] (一）基于连锁分析的烟草株高性状主效QTL发掘
[0029] 1.供试材料
[0030] 以美国引进优质烤烟品种NC82为母本，中国病毒病抗性品种抗88为父本构建Fp F2和F2 : 3人工群体为实验材料，两个品种之间在株高发育上存在明显差异，品种NC82在 营养生长期和生殖生长期株高正常伸长，但是抗88在营养生长期节距几乎不伸长，呈"莲 花"状，在生殖生长期恢复正常；群体构建过程如下：将NC82与抗88配置杂交种Fp匕自 交获得F 2，分别收获F2单株，构建F2 : 3株系。
[0031] 2.田间表型鉴定与分析
[0032] 试验在中国农业科学院即墨试验基地进行（纬度35. 4,经度119. 3)。第一年，以 NC82为母本，抗88为父本配置杂交组合，收获匕种子，同期种植匕，进而收获F2种子。第 二年，在大田条件下种植亲本、Fi和F 2群体。亲本和每分种植2行，每行25株，3次重复，株 距0. 5