用于有效基因递送应用的无毒hsv载体和用于其生产的补充细胞的制作方法
【专利说明】用于有效基因递送应用的无毒HSV载体和用于其生产的补充 细胞
[0001] 对相关申请的交叉引用。
[0002] 本申请要求2013年7月17日提交的美国临时专利申请号61/847,405的优先权，其 整个内容以其整体结合于本文。
[0003] 关于联邦政府资助的研究和开发的声明
[0004] 在由国立卫生研究院给予的补助金号P01DK044935和5R01NS064988下利用政府的 支持进行本发明。在本发明中，政府具有某些权利。
[0005] 发明背景
[0006] 在很多病毒和非病毒遗传载体系统中，已经研究基于单纯疱疹病毒(HSV)的载体 用作基因转移载体，包括可能在人患者中的治疗用途。HSV是能够感染非常宽泛的人和动物 细胞的复杂的、非整合DNA病毒。病毒基因组含有超过80个基因并且由两个独特的部分，U L 和仏组成，其各自侧面有编码关键二倍体基因的反向重复。HSV复制的重要特征是其基因一 批又一批的表达，称为级联调节(Rajcani，Virus Genes，28:293-310(2004))。去除关键立 即早期（IE)基因 ICP27和ICP4使得病毒完全缺陷，并且不能表达参与病毒基因组复制的早 期(E)基因和功能在于子代病毒颗粒组装的晚期(L)基因。这些复制缺陷病毒可以在表达 (补充的）缺失的ICP4和ICP27基因产物的补充细胞上生长，并且可以随后用于感染非补充 细胞，在那里病毒基因组作为稳定的核附加体存留。然而，保留ICP0和ICP22IE基因的载体 对细胞有毒性，但是将这些基因失活或缺失，尤其是ICP0基因，阻碍转基因表达。
[0007] 因此，仍然需要能够在不损害细胞或组织的情况下在任何组织或细胞中，体外或 体内表达转基因的HSV载体，和用于增殖这样的载体的系统。
[0008] 发明概述
[0009] 本发明涉及HSV载体改造中的突破，其提供了在不表达任何有害病毒基因的情况 下，在多种组织或细胞(特别是哺乳动物的），在体外或体内表达转基因的可能。本发明的 HSV载体在非补充细胞中不表达任何毒性病毒基因，但仍然能够强劲地，持续地(例如，达至 少14天，如至少28天，并且优选至少60天)表达转基因。因此，其填补了载体技术方面的极其 重要的孔板，因为HSV是仅有的将携带通过通用或细胞特异性启动子控制的大的单或多转 基因表达盒的能力与在没有载体整合的情况下的高效感染性质结合的载体。本发明的载体 将允许有效将基因递送至组织，如肝，对于其，目前没有可获得的有效载体。
[0010] 在一个实施方案中，本发明提供单纯疱疹病毒（HSV)载体，所述单纯疱疹病毒 (HSV)载体在非补充细胞中不表达毒性HSV基因，并且包含基因组，所述基因组包含一种或 多种转基因，其中所述载体能够在非补充细胞中表达转基因达至少28天。本发明的载体可 以包含与一种或多种绝缘子序列可操作相连地被插入基因组内的转基因，其中所述载体不 表达作为立即早期基因的1〇?0、10?4、10?22、10?27和10?47。根据启动子控制转基因的活 性，本发明的载体可以在其可以感染的任何类型的哺乳动物(尤其是人)细胞表达转基因而 没有病毒基因表达相关的细胞毒性。
[0011]在另一方面，本发明提供用于产生本发明的载体的补充细胞。本发明的细胞系源 自U20S细胞，其被改造成在所述细胞被HSV感染时表达ICP4和ICP27。
[0012] 附图简述
[0013]图1A是显示报告基因表达的载体示意图。顶部的线表示用于产生本发明的JANI 载体的全长野生型HSV-1 株KOS BAC克隆（Gierash，J· Virol .Meth ·，135:197-206(2006))。 第二条线表示J Δ NI5，即J Δ NI7-GFP的主链。第三条线是J Δ NI5的LAT至UL4区的放大。第4 条线的左侧（LAT:CAG-GFP)显示JANI7-GFP中的报告子表达盒的位置。第4条线的右侧 (UL3/4: CAG-GFP)显示源自J Δ NI5的对照载体(J Δ NI6-CAGGFP)中的相同表达盒的位置。图 1A符号表:TR，末端重复；IR，内部重复;UL，独特的长区域;US，独特的短;编号显示不同IE基 因的位置；A，缺失;β，早期启动子;CTRL，绝缘子;LAT P2,长期表达元件;CAG，CMV/肌动蛋 白/球蛋白增强子/启动子/内含子盒。图1B是一组显示报告基因表达的照片。图1B符号表： HDF，人真皮成纤维细胞;hpi，感染后小时数;dpi，感染后天数;Μ0Ι，感染复数。
[0014] 图2A-2B是一组比较J Δ NI6-CAGGFP和J Δ NI7-GFP感染的细胞中转基因表达的照 片。图2A显示以指定的Μ0Ι感染的HDF和U20S细胞中的GFP("EGFP"）和mCherry表达。感染后3 天获得荧光显微镜图像。图2B显示感染的HDF(M0I = 0.5)中转基因表达的持续时间。在感染 后卜14天获得图像。
[0015] 图3是一组显示J Δ NI7-miR302GFP病毒在补充（U20S-ICP4/ICP27)细胞上扩张的 照片。在感染后3天拍摄照片。
[0016] 图4是用于将四环素诱导型启动子和Gateway重组盒插入HSV载体的LAT基因座的 靶向质粒的构建的示意图。图4符号表:Zeo,博莱霉素-抗性基因；Cm，氯霉素-抗性基因； ccdB，用于负选择的毒素基因；LATP2，LAT长期表达元件;CTRL2，LAT基因座的染色质边界/ 绝缘子元件2。
[0017] 图5是用于在U20S-ICP4细胞系中表达ICP27的慢病毒质粒的构建的示意图。图5符 号表:P，启动子;bla，杀稻痕菌素抗性基因。
[0018] 图6A是一组显示用Q0ZHG病毒（ICP4-空；ICP27-空)感染的U20S-ICP4细胞和不同 克隆U20S-ICP4/ICP27细胞的ICP27免疫荧光染色的照片。图6B是一组显示Q0ZHG病毒(在病 毒基因组中从HCMV启动子-GFP盒的GFP表达)在U20S-ICP4和U20S-ICP4/ ICP27细胞中的生 长的照片。
[0019] 图7是本发明的HSV载体(J Δ NI7-GFP，中间），J Δ NI7-GFP的LAT区（顶部），和野生 型HSV的LAT区（底部）的示意图。
[0020]图8是本发明的JANI7-GFP HSV载体的LAT区的序列。
[0021] 图9A-9C.载体基因组结构和用于病毒生产的补充细胞。（图9A)K0S-37BAC(24)中 的野生型HSV-1K0S基因组和IE基因缺失的衍生物J Δ NI2, J Δ NI3和J Δ NI5的基因组的示意 性表示。UL，独特的长区段;US，独特的短区段。开放框:末端和内部的反相重复。BAC元件，包 括氯霉素-抗性基因和半乳糖苷酶表达盒，位于UL37-UL38基因间的区域中的ΙοχΡ位点之 间（Gierasch等人，J. Virol .Methods 135,197-206(2006))。将K0S-37BAC及其衍生物中的 US区与HSV基因组的标准表示反向比较。J Δ NI构建体中的缺失由黑色框和Δ符号表示;将 ICP47启动子和翻译起始密码子移除作为接合处（joint)缺失的部分。通过启动子替换 (ICP0，ICP27)或TAATGARAT缺失（ICP22)转变为早期表达动力学的IE基因由阴影框和ICP编 号之前的β符号表示。所有JANI重组子在gB基因中含有高度激活N/T突变(Uchida等人， J. Virol. 84，12200-09 (2010))和在 ICP4基因座中的泛素 C 启动子（UbCp)-mCherry 盒； mCherry盒的SV40po lyA区由小的图案框表示。（图9B)补充细胞的蛋白质印迹分析。在24hp i 收获未感染的细胞和以1的M0I用Q0ZHG(左）或JANI5病毒（右)感染的细胞，并且制备提取 物用于凝胶电泳。印迹用针对ICP4，ICP27,或作为上样对照的α-微管蛋白的抗体探测。（图 9C)JANI2和 JANI5病毒在 1]205，1]205-比?4，1]205-比?4/27，和￥61〇-713细胞中的生长。以 0.001的Μ0Ι感染细胞并且每天从一式三份的孔中收获细胞外病毒，并在U20S-ICP4/27细胞 上测定滴度。
[0022]图10Α-10Β.用等量gc或PFU感染后的相对核病毒DNA水平。将HDF用指定的JANI载 体以5，OOOgc/细胞（图10A)或1PFU/细胞（图10B)感染。在2hpi，分离核DNA并且通过用于相 对细胞18S rRNA基因归一化的gD基因的qPCR确定相对病毒gc数量。
[0023]图11A-11D.在非补充细胞中的JANI细胞毒性和病毒基因表达。（图11A)体外细胞 毒性测定。以25,00(^〇/细胞感染!10?和￥6仰细胞并且在5(1?丨在一式三份的孔中通过阶1'测 定测量细胞存活力。绘制的值表示病毒-感染相对空白感染的细胞的平均比例。带有星号的 括号表示J Δ NI2和J Δ NI3感染的Vero细胞之间和J Δ NI3和J Δ NI5感染的Vero细胞之间的 统计学显著的差异(P<〇.〇5)。（图11B).HDF中的IE基因产物的蛋白质印迹分析。以1PFU/细 胞用K0S，Q0ZHG或JANI病毒感染细胞并且在24hpi制备提取物。将印迹用针对指定的IE基 因产物或作为上样对照的α_微管蛋白的抗体探测。（图11C)通过qRT-PCR测量的J△ NI IE基 因表达。用指定的病毒以l，〇〇〇gc/细胞感染HDF。在12hpi分离mRNA并反转录用于qPCR确定 顶部列出的基因的cDNA水平。将表达相对18S rRNA水平归一化并且相对J △ NI2感染的细胞 显示。（图11D)对早期（上图）和晚期基因（下图）的表达的qRT-PCR分析。感染HDF并如（图 11C)中那样进行处理。ICP6可以被认为是延迟的IE基因并且在本文中被归类为早期基因， 因为据报道，与VP16或ICP4相比，其表达更依赖于ICP0(Desai等人，J.Virol.67,6125-35 (1993); Sze等人，Virus Res .26,141-52(1992) ;Harkness等人，J. Virol .88( 12)6847-61 (2014))〇
[0024] 图12A-12D. J Δ NI感染的HDF中的报告基因表达。（图12A)mCherry荧光。以指定的 gc/细胞感染细胞并且在24hpi拍照。（图12B)相对mCherry mRNA水平。以5，OOOgc/细胞感染 HDF并且在6hpi收获用于mRNA分离，逆转录和qPCR，如图3C中。（图12C)U20S细胞中的 mCherry荧光。以l，000gc/细胞感染细胞并在24hpi拍照。（图12D)在JANI5感染的HDF中诱 导mCherry表达。以指定的gc/细胞感染细胞，在24h用Q0ZHG以5，OOOgc/细胞进行超感染，并 在24h后拍照。
[0025] 图13A-13D. JANI6GFP和JANI7GFP基因组结构和报告基因表达。（图13A)JA NI7GFP含有在LATP2长期表达/增强子区域之间的2-kb LAT内含子区域内的CAG启动子-EGFP表达盒和在内含子中的下游CTCF-结合基序(CTRL2)。LATP2从LAT转录起始位点延伸至 2-kb内含子内。J Δ NI6GFP在UL3和UL4基因之间含有相同的CAG启动子-EGFP表达盒。CAGp-EGFP盒的兔β-球蛋白po 1 yA区域由小的图案框表示。（B-D)感染的HDF中的EGFP和mCherry表 达。（图13B)用J Δ NI6GFP或J Δ NI7GFP病毒以不同gc/细胞感染细胞并且在3dpi使荧光可视 化。（图13C)用J Δ NI6GFP或J Δ NI7GFP载体以12，500gc/细胞感染HDF并且3或5d后收获用于 2个报告基因的mRNA提取和qRT-PCR分析。在第3天显示相对于JANI6GFP感染的细胞的相对 于18S rRNA归一化的表达。（图13D)用J Δ NI6GFP或J Δ NI7GFP病毒以25，000gc/细胞感染 HDF并且在7，14和28dpi将EGFP荧光拍照。
[0026] 图14A-14C · LAT基因座元件对来自J Δ NI7GFP的EGFP表达的影响。（图14A)CTRL1 (Δ Cl)，CTRL2( Δ C2)或LATP2 ( Δ LP2)分别或组合缺失的J Δ NI7GFP和衍生物的基因组表 示。JQ673480中的位置8978-9161的缺失包括CTRL1，并且JQ673480中的位置5694-5857的缺 失包括CTRL2。这些缺失包括一些CTCF结合基序外的碱基。（图14B)感染的HDF中的报告基因 表达。用指定的病毒以12,500gc/细胞感染细胞，并且在3dpi记录荧光。（图14C)用JA NI7GFP，LAT元件缺失的衍生物，或J Δ NI6GFP感染的HDF中的相对EGFP mRNA水平;通过缩写 名称鉴别病毒。以12,500gc/细胞感染细胞并且在3dpi处理以用于qRT-PCR分析。相对18S rRNA将表达水平归一化，并且相对于J △ NI7GFP感染的细胞的水平显示。
[0027]图15A-15D.位于病毒基因组中其他地方的LAT序列的抗沉默活性。（图15A)JANI9 和JANI10载体的构建。将包括CTRL1，LATP2和CTRL2的Xhol片段从JANI5基因组中去除，并 且在UL45和UL46之间引入GW重组盒以产生J Δ NI9GW或在UL50和UL51之间引入GW重组盒以 产生J Δ NI10GW(上部）。相同的Xhol位点用于从J Δ NI7GFP分离含CAGp-GFP的LAT片段(下部 左侧）。将Xhol片段克隆入pENTRlA(下部右侧)并且通过attL/attR重组利用各自的GW盒(LR 反应)转至J Δ NI9GW或J Δ NI10GW中，以分别产生J Δ NI9LAT-GFP和J Δ NI10LAT-GFP。作为对 照，没有LAT序列的CAGp-GFP盒经由pENTRlA中间体重组入J Δ NI9GW或J Δ NI10GW的GW基因 座，产生J Δ NI9GFP和J Δ NI 10GFP。（图15B)用J Δ NI9或J Δ NI10病毒感染的HDF中的报告基 因表达。用指定的病毒以12，500gc/细胞感染HDF。在3dpi记录EGFP和mCherry荧光。（图15C) 如在之前的附图中，通过qRT-PCR确定的在感染的HDF中的EGFP mRNA水平。显示相对于J Δ NI9GFP或J Δ NI 10GFP感染的细胞的水平。与上述J Δ NI 10LAT-GFP的构建类似，通过将来自J Δ NI7 Δ C12LP2-GFP的Xhol LAT片段转至J Δ NI 10GW的GW位点中，构建J Δ NI10 Δ C12LP2-GFP。（图15D)CTRL和LATP2二者从J Δ NI 10LAT-GFP缺失对转基因表达的影响。以12，500gc/ 细胞感染HDF并且在3dpi记录EGFP和mCherry荧光。
[0028]图16A-16D.在其他非补充细胞中的自J Δ NI载体的报告基因表达。（图16A)将顶部 列出的细胞用JANI6GFP或JANI7GFP以图下方指定的gc/细胞感染。在3dpi记录EGFP和 mCherry荧光。（图16B)在3dpi通过qRT-PCR分析测量如在（图16A)中那样感染的细胞中的 EGFP基因表达。相对于J Δ NI6GFP感染的细胞，显示相对于18S rRNA归一化的结果。（图16C) 用J Δ NI6GFP或J Δ NI7GFP病毒以50，000gc/细胞感染hMDSC并且在14和28dpi将EGFP荧光拍 照。（图 16D)在用J Δ NI 10GFP或J Δ NI10: LAT-GFP以 12，500gc/细胞感染3d后hEK，hPAD和 hHEP细胞中的EGFP mRNA水平的qRT-PCR测定。相对于JANI10GFP感染的细胞，显示归一化 的表达。
[0029] 图17通过图表显示从JANI5构建JANI8。
[0030]图18显示关于以1基因组拷贝（gc)/细胞感染后，J Δ NI8相对于J Δ NI5在补充细胞 (U2GS-ICP4/27)中的生长的数据。上图显示报告基因表达(mCherry)，而下面的左图以噬斑 形成单位(PFU)报告病毒产量，并且下面的右图以基因组拷贝（gc)报告病毒产量。
[0031] 图19显示证明与从JANI5相比，在补充细胞中病毒基因更早从JANI8表达的数 据。在每个图中，下部线条表示JANI5的数据，而上部线条表示JANI8的数据。通过qRT-PCR 收集数据并且表达为在感染后6小时(hpi)相对于JANI5数据点的倍数差异。
[0032] 图20通过图表显示JDNI7GFP(也称为J Δ NI7GFP)和JDNI8GFP(也称为J Δ NI8GFP) 的基因组结构。
[0033] 图21显示证明用等量的J Δ NI8和J Δ NI5(表示为gc)感染人真皮成纤维细胞(HDF) 细胞导致核中等量的病毒DNA的数据。数据代表感染后两小时(hpi)。
[0034] 图22显示比较用不同HSV载体以两个M.O.I.感染的HDF的细胞存活力(MTT)的数 据。每个图中下部的-X-线表示JANI5的结果，而每个图中上部-X-线表示JANI8的结果。 [0035]图23显示比较用不同HSV载体以不同数量的病毒基因组拷贝/细胞感染的HDF的细 胞存活力分析(MTT)的数据。对于左图（12500gc/细胞），JANI5的M.0丄是5PFU/细胞，而J ΔΝΙ8 的 M.O.I.是18PFU/细胞。对于右图（25000gc/细胞），JANI5的 M.O.I.是11，而JANI8 的Μ. 0.1.是33。每个图中的下部-X-线表示J Δ NI5的结果，而每个图中的上部-X-线表示J Δ ΝΙ8的结果。
[0036]图24表示比较在六种细胞类型（HDF，人新生儿角质形成细胞，人神经干细胞， Vero,人前脂肪细胞，和人肝细胞）中用K0SJANI5和JANI8感染的细胞的存活力的数据。 使用25,000gc/细胞进行MTT测定，在感染后5天(dpi)报告数据。
[0037]图25显示在感染后三天比较以指定的gc/细胞用JANI7GFP和JANI8GFP感染的人 真皮成纤维细胞(HDF)之间的报告基因表达(mCherry或增强型绿色荧光蛋白（EGFP))的剂 量响应数据。
[0038] 图26显示比较以25，000gc/细胞用J Δ NI7GFP和J Δ NI8GFP感染的人真皮成纤维细 胞(HDF)之间的报告基因表达(mCherry或EGFP)的时间进程数据。
[0039] 图27显示比较用12，500gc/细胞或25，OOOgc/细胞的J Δ NI7GFP或J Δ NI8GFP感染 后三天人新生儿角质形成细胞的报告基因表达(mCherry或EGFP)的实验结果。
[0040] 图28显示比较用6250gc/细胞的J Δ NI7GFP或J Δ NI8GFP感染后三天大鼠背根节 (DRG)神经元的报告基因表达(mCherry或EGFP)的实验结果。
[0041 ] 图29显示研究用JANI7GFP感染的神经细胞中的转基因表达(mCherry或EGFP)的 实验结果。顶部，在指定的感染后天数(dp i)的EGFP和mCherry焚光的分开的（左侧;40x)或 合并的（中间，右侧;20x)图像;底部，在15dpi分开的和合并的图像(1 Ox)。
[0042] 图 30 是 pCX4Hyg_Cre 的示意图
[0043] 图31是产生pCX4Hy g-Cre的示意性表示。
[0044] 图32显示比较如通过定量逆转录(RT)-PCR确定的J Δ NI7GFP和J Δ NI6GFP感染的 HDF细胞之间的EGFP mRNA水平的数据。
[0045] 发明详述
[0046] 以下与各种HSV载体技术相关的专利和出版物通过引用结合于本文。美国专利号 5,658,724涉及10?4和10?27缺陷的批￥株和它们的生产、生长和使用方法。美国专利号5， 804,413涉及包含编码ICP4，ICP27和ICP0的DNA的细胞系。美国专利号5,849,571涉及潜伏 活性疱疹病毒启动子和它们的用途。美国专利号5,849,572涉及含有LAT启动子的HSV-1载 体。美国专利号5,879,934涉及在10?4和10?27基因内包含基因组突变以致10?4和10?27基 因产物缺陷的重组HSV载体。美国专利号5，998，174涉及制备HSV载体的方法。美国专利号6， 261，552涉及包含在天然了44了641^1'序列内具有缺失或突变的批￥基因组的批￥载体，其中所 述缺失或突变导致当所述基因组在含有HSV ICP4基因产物的细胞内时，所述基因组内的天 然立即早期基因的表达动力学延迟。美国专利号7,078,029涉及具有了44了6六1^1'序列的突变 的基因组的HSV，以致，在ICP4基因产物存在下，天然立即早期基因以延迟的动力学从基因 组表达。美国专利号7,531，167涉及仅在扣?4，扣?27，和见55基因中包含缺失的批￥载体。美 国专利申请公开号2013/0096186涉及包含突变体gB和/或突变体gH糖蛋白的HSV载体。国际 专利申请公开号WO 1999/06583涉及包含包括非天然配体的被膜的HSV。
[0047]在一个实施方案中，本发明提供在非补充细胞中不表达毒性的天然HSV基因并且 能够持续表达转基因的单纯疱疹病毒(HSV)载体。例如，本发明的HSV载体可以在培养的人 真皮成纤维细胞(HDF)