一种高效表达石杉碱甲的真菌菌株及其应用
【技术领域】
[0001 ]本发明属于微生物技术领域，具体设及一种高效表达石杉碱甲的真菌菌株，本发 明还设及该真菌菌株的应用。
【背景技术】
[0002] 目前乙酷胆碱醋酶抑制剂类药物在阿尔茨海默病药物市场上处于主导地位。石杉 碱甲为从民间草药蛇足石杉中分离获得的新型石松类单体生物碱，是一种强效的可逆性的 胆碱醋酶抑制剂，具有多祀点作用，对乙酷胆碱醋酶的抑制作用为毒扁豆碱的3倍、加兰他 敏的30倍，而且外周不良反应低，是治疗阿尔茨海默病临床优选药物之一。
[0003] 源于天然植物的药物开发历史悠久且富有生命力，植物提取获得石杉碱甲为最简 便方式，但植物提取获得石杉碱甲已面临植物资源匿乏瓶颈;化学合成生产石杉碱甲仍是 研发重要途径之一，但合成步骤繁琐、代价昂贵，很难获得纯光学活性的合成物。
[0004] 因此利用从野生蛇足石杉内生真菌中筛选分离具有产石杉碱甲能力的菌株对于 治疗阿尔茨海默病和保护植物资源意义重大。虽然目前国内外已有对产石杉碱甲菌株进行 开发和研究，但总状毛霉(Mucor racemosus)具备产石杉碱甲功能却鲜有报道。对已获得的 总状毛霉(Mucor racemosus)N甜-D株可通过生物技术改造菌株为获得石杉碱甲工业化生 产提供新的菌种资源。同时，通过对其菌株产石杉碱甲机理的研究，构建新的转基因生物， 使其获得更优良稳定的产石杉碱甲性状和能力。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种高效表达石杉碱甲的真菌菌株，解决植物提取获得石杉 碱甲面临植物资源匿乏瓶颈；W及化学合成步骤繁琐、代价昂贵，很难获得纯光学活性的合 成物的问题。
[0006] 本发明的另一个目的是提供一种高效表达石杉碱甲的真菌菌株的应用。
[0007] 本发明所采用的技术方案是，一种高效表达石杉碱甲的真菌菌株，该菌株为从野 生蛇足石杉化uperzia serrata石杉科，石杉属）内生真菌中分离获得，属于毛霉属总状毛 霉(Mucor racemosus)种NSH-D株，在实验室传代15代后具有遗传稳定性，其氨基序列如SEQ ID NO: 1 所示。
[000引本发明的特点还在于，
[0009] 该真菌菌株高效表达石杉碱甲培养条件为：
[0010] (1)培养基：采用PDA液体培养基，具体配方为：马铃馨300g，葡萄糖20g，蒸馈水 1000ml；
[0011] (2)培养条件:26.5°(：，220以111111;
[001 ^ (3)装液量：250ml锥形瓶，装液量为100ml;
[OOU] (4)培养时间：6天。
[0014]该真菌菌株高效稳定性表达石杉碱甲时，该菌株的实验室保存条件为：（1)菌株每 次在PDA固体斜面传代后，生长时间为60h;(2)保存菌种条件为4°C，1化后在将其放置-25°C 冰箱中进行保存。
[0015] 本发明所采用的另一个技术方案是，一种高效表达石杉碱甲并作为治疗阿尔茨海 默病的功能菌株在生物合成制药方面的应用。
[0016] 本发明所采用的第Ξ个技术方案是，一种高效表达石杉碱甲的真菌菌株的应用， 通过转基因、诱变育种对真菌菌株进行基因改造，W获得表达效率更高、遗传稳定性更好的 系列菌株;但基因改造的技术手段并不限于此，也可W采用其他的生物技术进行基因改造 方面的应用。
[0017] 本发明的有益效果是，本发明一种高效表达石杉碱甲的真菌菌株，作为治疗阿尔 茨海默病的生物菌株，将其优良的产石杉碱甲高效表达基因转入其他模式菌株中，通过基 因改造获得更多的优良性状，此外还可通过诱变育种达到菌株的进一步优化。对其研究将 会为生物合成工业化生产石杉碱甲，保护植物资源、解决临床一线用药需求、降低治疗阿尔 茨海默病医药费用有着巨大意义。
【附图说明】
[0018] 图1是本发明高效表达石杉碱甲的真菌菌株产石杉碱甲能力与石杉碱甲标准品高 效液相检测对照图，图中，a为石杉碱甲标准品高效液相色谱，b为本发明真菌菌株高效液相 色谱；
[0019] 图2为琼脂糖凝胶电泳检测本发明真菌菌株中所抽提DNA的PCR产物电泳图，图中， a为菌株检测区，b为Marker对照区；
[0020] 图3为本发明高效表达石杉碱甲的真菌菌株光学显微镜图，图中，a为光学显微镜 下球形抱子囊，b为光学显微镜下有隔菌丝，C为光学显微镜下球形、短楠圆形抱子。
【具体实施方式】
[0021 ]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明进行详细说明。
[0022] 本发明一种高效表达石杉碱甲的真菌菌株，该菌株为从野生蛇足石杉化uperzia serra化石杉科，石杉属）内生真菌中分离获得，属于毛霉属总状毛霉(Mucor racemosus)种 NSH-D株，在实验室传代15代后具有遗传稳定性，其氨基序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0023] 该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位中国普通微生物菌种保藏中屯、保藏。
[0024] 生物材料保藏信息：
[00巧]名称：总状毛霉(Mucor racemosus)NSH-D株
[0026] 保藏编号:CGMCC No.12077
[0027] 保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、(CGMCC)
[002引保藏时间：2016年01月15日
[0029] 地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号
[0030] ( - )本发明高效表达石杉碱甲菌株的分离方法如下：
[0031] 将新鲜蛇足石杉植株用自来水冲洗后，先用75%酒精进行表面消毒30s，无菌水冲 洗4次，接着用10%化αο浸泡5min，无菌水冲洗4次，最后再用75%乙醇表面消毒30s，无菌 水冲洗4次后，用无菌刀片将茎切成0.5cm大小，叶片切成0.3cm X 0.3cm小块，接种到含有15 μg/ml链霉素和Img/ml脱氧胆酸钢的PDA固体培养基上，倒置于28°C培养箱中进行暗培养。 为了检验上述表面消毒是否彻底，同时把在消毒过程中最后一次冲洗组织块的无菌水涂布 在培养基上进行培养。2~3d后，无菌操作法挑取在茎段和叶片切口上所长出的菌丝，平板 划线法转接到新鲜的PDA平板上，重复上述操作直到得到纯化的内生真菌为止。
[0032] (二)高效表达石杉碱甲菌株发酵液制备:将分离得到的纯化内生菌分别接入装有 100ml PDA培养基的250ml锥形瓶(每个菌株接3瓶），置于摇床上，26.5°C、220r/min振荡培 养6d。设置3个重复。内生真菌在振荡培养6d后，发酵液于1000化/min离屯、15min。
[0033] (Ξ)高效表达石杉碱甲菌株产物分析测定:取发酵液离屯、后的上清液50ml，采用 氯仿和乙酸提取方法提取石杉碱甲，用甲醇定容到5ml，用高效液相法测定发酵上清液产石 杉碱甲的含量。高效液相化PLC)色谱柱为Agilent C18柱(4.60mmX250mm，5皿）；色谱条件 为:流动相为甲醇-0.1 %甲酸（75: 25);流量1.0ml/min;柱溫25 °C，进样量20μ1;检测波长 31 Onm。W石杉碱甲标准品作对照。
[0034] 精密称取石杉碱甲标准品20mg，溶于20mL蒸馈水中，再依次制备成0.05，0.025， 0.0125,0.006,0.003111旨/1111质量浓度，分别进样2041。每次5次重复，^确定精密度良好。^ 峰面积与对应石杉碱甲标准品质量绘制标准曲线，得线性回归方程。通过线性回归方程计 算分离获得产石杉碱甲菌株代谢产物含量。结果表明石杉碱甲标准品出峰时8.805min(图 1，曰），线性回归方程为y = -16.40713+1059.