提高S-腺苷-L-半胱氨酸水解酶免疫原性的方法及六糖修饰ahcy蛋白的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及蛋白质的免疫原性技术领域，具体涉及一种提高S-腺苷-L-半胱氨酸水解酶免疫原性的方法及六糖修饰ahcy蛋白。
【背景技术】
[0002]S-腺昔-L-半耽氛酸水解酶(S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase，ahcy)是布鲁氏菌免疫原性蛋白，是预防布鲁氏菌的亚单位疫苗的候选抗原，对布鲁氏菌具有较好的免疫保护。
[0003]布鲁氏菌属于胞内寄生菌，目前还没有理想的治疗手段和药物，疫苗预防是防控该病的唯一有效手段。布鲁氏菌的免疫机制目前还没有完全清楚，但是无论是体液免疫反应还是细胞免疫反应对布鲁氏菌的清除都是起作用的，但是细胞免疫反应是排除胞内寄生菌最主要的免疫机制。布鲁氏菌活的弱毒疫苗以及一些保护性抗原配合佐剂都能够诱导很强的细胞免疫反应。目前布鲁菌病疫苗的种类较多，世界大约有200多种布鲁氏菌疫苗，主要包括弱毒活菌苗，灭活疫苗，突变株疫苗，基因工程苗和抗独特型抗体苗等。由于一些弱毒疫苗，灭活疫苗都存在着一些缺陷以及一些新疫苗的研制又都处于实验室阶段，致使目前还没有更加理想的布鲁氏菌疫苗用于控制人畜布病。所以当前布鲁氏菌疫苗的研究也主要集中在筛选弱毒株，构建突变株以及寻找亚单位疫苗等方面。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是为了给布鲁氏菌提供更好的疫苗候选抗原，提供一种提高S-腺苷-L-半胱氨酸水解酶免疫原性的方法及六糖修饰ahcy蛋白。
[0005]本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下:
[0006]本发明的提高S-腺苷-L-半胱氨酸水解酶免疫原性的方法，包括以下步骤:
[0007]步骤一、4°C下，将六糖与高碘酸钠按摩尔比为1:1的比例混合，在pH 6.0的I3BS中反应Ih;
[0008]步骤二、室温下，按EDC与NHS的摩尔比为1:1的比例，向步骤一所得反应体系中加入EDC和NHS，反应6h;
[0009]步骤三、室温下，按ahcy蛋白与六糖的摩尔比为1:1000的比例，向步骤二所得反应体系中加入ahcy蛋白，过夜反应；
[0010]步骤四、4°C下，在50mmol/L、pH8.0?9.6的碳酸盐溶液中透析511;
[0011]步骤五、4°(:下，在50臟01/1^!17.0?8.0的？85中透析一天。
[0012]进一步的，所述ahcy蛋白通过以下方法制备:
[0013]步骤一、将大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3)制备成感受态细胞后，转化重组质粒pET28a_ahcy 构建 pET-28a_ahcy/BL21 表达菌株，pET-28a_ahcy/BL21 表达菌株用终浓度lmmol/L的IPTG诱导6h表达蛋白；
[0014]步骤二、离心收集E.coli BL21细胞，用PBS洗涤2次，5000rmp/min，离心15min，收集菌液；
[0015]步骤三、加入冰预冷的50mmol/L、pH8.0的Tris-HCl和2mmol/L的EDTA，洗涤菌液一次，所加入的Tris-HCl和EDTA的总体积为菌液体积的1/5;
[0016]步骤四、离心收集菌液，重悬于冰预冷的10mmol/L、pH8.0的Tris-HCl中，Tris-HCl的体积为菌液体积的1/10，加入溶菌酶至0.lmg/ml，再加入I %的Triton X-100，37 °C孵育15min；
[0017]步骤五、加入终浓度为lmmol/L的PMSF，置冰浴中超声裂解菌体，超声lOsec，间歇1sec，最大功率300W、超声30min，超声破碎直至溶液不再粘稠且呈现透明状态；
[00? 8] 步骤六、12000rpm，4 °C离心30min，取离心上清液用0.45μηι滤膜过滤，对过滤后的上清液进行SDS-PAGE验证分析，结果目的蛋白大小为55KD，与预期大小相同。
[0019]步骤七、His Trap FF亲合层析柱纯化目的蛋白:
[0020](I) 5个柱体积的馏水洗涤柱；
[0021 ] (2)5个柱体积的Elut1n buffer洗涤柱；
[0022](3)5个柱体积的馏水洗涤柱；
[0023](4) 10个柱体积的Binding buffer平衡柱；
[0024](5)上样，过柱，要注意液体过柱的流速，控制在lml/min;
[0025](6)5个柱体积的Binding buffer洗脱杂蛋白；
[0026](7)5?10个柱体积的Elut1n buffer洗脱目的蛋白，并回收至新的EP管里，对纯化后的ahcy蛋白进行SDS-PAGE验证分析，结果纯化后的目的蛋白大小为55KD，与预期大小相同。
[0027]通过上述的提高S-腺苷-L-半胱氨酸水解酶免疫原性的方法获得的六糖修饰ahcy蛋白，其刺激增殖指数IS是ahcy蛋白的2.77倍，抗体效价IgG较ahcy蛋白在4?5周时提高I倍，刺激小鼠脾淋巴细胞后产生细胞因子IFN- γ的量是ahcy蛋白的6.86倍，刺激小鼠脾淋巴细胞后产生细胞因子IL-2的量是ahcy蛋白的4.87倍。
[0028]本发明的有益效果是:
[0029]本发明提供了一种提高ahcy蛋白免疫原性的方法，是一种布鲁氏菌提供新的亚单位疫苗的制备方法，进一步提高该蛋白诱导细胞免疫和体液免疫水平。本发明使用化学合成方法对ahcy蛋白进行甘露寡糖修饰，实验找出稳定的寡糖修饰方法，得到的糖蛋白免疫小鼠检测小鼠脾细胞淋巴细胞增殖、血清中抗体消长、脾细胞原代培养液中细胞因子的含量，筛选出对蛋白免疫原性改变较大的寡糖修饰蛋白。
[0030]ahcy蛋白、六糖修饰蛋白(ahcymhe)刺激小鼠脾淋巴细胞的IS(刺激增殖指数)分别为1.63和4.52，六糖修饰蛋白(ahcymhe)的IS是ahcy蛋白的2.77倍。
[0031 ] ahcy蛋白、六糖修饰蛋白(ahcymhe)的抗体效价IgG分别为1:64000和1:128000，六糖修饰蛋白(ahcymhe)抗体效价IgG较ahcy蛋白在4?5周时提高I倍。
[0032]ahcy蛋白、六糖修饰蛋白(ahcymhe)刺激小鼠脾淋巴细胞后产生细胞因子IFN-γ的量分别为902.27pg/ml和6192.045pg/ml，六糖修饰蛋白(ahcymhe)刺激小鼠脾淋巴细胞后产生细胞因子IFN-γ的量是ahcy蛋白的6.86倍。
[0033]ahcy蛋白、六糖修饰蛋白(ahcymhe)刺激小鼠脾淋巴细胞后产生细胞因子IL_2的量分别为43.23pg/ml和166.76pg/ml，六糖修饰蛋白(ahcymhe)刺激小鼠脾淋巴细胞后产生细胞因子IL-2的量是ahcy蛋白的4.87倍。
【附图说明】
[0034]图1为ahcy蛋白诱导表达的SDS-PAGE结果。图中:泳道I为未诱导的pET-28a_ahcy/BL21细胞裂解液;泳道2为诱导的pET-28a-ahcy/BL21细胞裂解液;泳道3为诱导的pET_28a-ahcy/BL21细胞裂解液上清;泳道4为诱导的pET-28a_ahCy/BL21细胞裂解液沉淀；泳道5为诱导的pET-28a-ahcy/BL21细胞裂解液上清；泳道6为诱导的pET-28a-ahcy/BL21细胞裂解液沉淀。
[0035]图2为纯化的ahcy蛋白的SDS-PAGE结果。图中:泳道I为诱导的pET-28a_ahcy/BL21细胞裂解液;泳道2和泳道3均为纯化后洗脱的ahcy蛋白。
[0036]图3为小鼠脾淋巴细胞增殖试验结果。图中:ahcym表示单糖修饰ahcy蛋白，ahcymbi表示二糖修饰ahcy蛋白，ahcymtr表示三糖修饰ahcy蛋白，ahcymte表示四糖修饰ahcy蛋白，ahcympe表示五糖修饰ahcy蛋白，ahcymhe表示六糖修饰ahcy蛋白。
[0037]图4为免疫小鼠后测定小鼠抗体效价增长曲线。图中:ahcymbi表示二糖修饰ahcy蛋白，ahcymte表示四糖修饰ahcy蛋白，ahcympe表示五糖修饰ahcy蛋白，ahcymhe表示六糖修饰ahcy蛋白。
[0038]图5为细胞因子INF-γ含量检测结果。图中:ahcymbi表示二糖修饰ahcy蛋白，ahcymte表示四糖修饰ahcy蛋白，ahcympe表示五糖修饰ahcy蛋白，ahcymhe表示六糖修饰ahcy蛋白ο
[0039]图6为细胞因子IL-2含量检测结果。图中:ahcymbi表示二糖修饰ahcy蛋白，ahcymte表示四糖修饰ahcy蛋白，ahcympe表示五糖修饰ahcy蛋白，ahcymhe表示六糖修饰ahcy蛋白ο
[0040]图7为细胞因子IL-10含量检测结果。图中:ahcymbi表示二糖修饰ahcy蛋白，ahcymte表示四糖修饰ahcy蛋白，ahcympe表示五糖修饰ahcy蛋白，ahcymhe表示六糖修饰ahcy蛋白ο
【具体实施方式】
[0041]下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0042]实施例1ahcy蛋白的制备及纯化
[0043]l、ahcy蛋白的制备
[0044](I)将大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3)制备成感受态细胞后，转化重组质粒pET28a_ahcy 构建 pET-28a_ahcy/BL21 表达菌株，pET-28a_ahcy/BL21 表达菌株用终浓度lmmol/L的IPTG诱导6h表达蛋白；
[0045](2)离心收集E.coli BL21细胞，用PBS洗涤2次，5000rmp/min，离心15min，收集菌液；
[0046](3)加入冰预冷的 50mmol/L 的 Tris-HCl (pH8.0)和 2mmol/L 的 EDTA，洗涤菌液一次，所加入的Tr i s-HCl和EDTA的总体积为菌液体积的I /5;
[0047](4)离心收集菌液，重悬于冰预冷的1mmoI/L的Tris-HCl(pH8.0)中，Tris-HCl的体积为菌液体积的1/10，加入溶菌酶至0.lmg/ml，再加入I %的Tri ton X-100，37 °C孵育15min；
[0048](5)加入终浓度为lmmol/L的PMSF，置冰浴中超声裂解菌体，超声lOsec，间歇1sec，最大功率300W、超声30min，超声破碎直至溶液不再粘稠且呈现透明状态；
[0049](6)12000rpm，4°C离心30min，取离心上清液用0.45μπι滤膜过滤，过滤后上清液经SDS-PAGE验证后用于目的蛋白纯化。
[0050]ahcy蛋白经SDS-PAGE验证分析后的结果如图1所示，目的蛋白大小为55KD，与预期大小相同。
[0051]2、His Trap FF亲合层析柱纯化目的蛋白
[0052](I) 5个柱体积的馏水洗涤柱；
[0053](2)5个柱体积的Elut1n buffer洗涤柱；
[0054](3)5个柱体积的馏水洗涤柱；
[0055](4) 10个柱体积的Binding buffer平衡柱；
[0056](5)